神经生长因子在脊髓损伤后神经再生中的表达变化

神经生长因子在脊髓损伤后神经再生中的表达变化

脊柱损伤（rc）是导致下肢功能障碍的重要原因。高级哺乳动物SCI后,再生能力弱。神经再生环境是神经生长的基础环境,目前研究已经明确了再生[ActaUnivMedNanjing,2008,28(07):868-871]环境中多种因子参与神经再生的调节,包括增强神经内在再生能力的神经生长因子BDNF、调控轴投射和神经元迁移的神经导向因子slit等。BDNF不仅对发育中的神经元有神经营养和分化的作用,还参与了神经损伤修复的调控,能够促进神经再生,修复损伤的神经细胞。SCI可激活或改变slit的表达。观察脊髓损伤后BDNF、slit表达以及形态学、肢体功能和神经功能变化的规律,明确脊髓损伤后再生环境中“允许”作用的变化规律具有重要意义。1材料和方法1.1动物实验组雄性SD大鼠45只,随机分成正常组,假手术组和手术后1、3、5、7、14、21、28天组,每组各5只。1.2方法1.2.1涉及临床的临床信息在脊髓背后置一弧形垫片,重锤落下时正砸此垫片上,以使其损伤情况更接近临床。为使致伤部位所受致伤力均匀,防止重锤偏移落点中心,设计重锤的致伤端呈弧形凹面,其圆形直径与脊髓横径相等致伤能量为40gcm(10g重量自4cm高处落下),以造成不完全性脊髓损伤模型。1.2.2石蜡标本的制作术后不同时间点用戊二醛麻醉大鼠,打开腹腔,向上破坏膈膜,剪断肋骨,暴露心脏,经左心室快速灌注生理盐水200ml,4%多聚甲醛(PBS由DEPC水配置)灌注固定8h,常规制成石蜡标本,横段面切片4!m厚。行HE染色,嗜银染色进行细胞形态观察。1.2.3神经传导通路功能恢复应用脊髓运动功能行为学评分BBB法观察脊髓损伤后大鼠后肢功能恢复情况;应用体感诱发电位(SEP)测定方法进行电生理检查:按1%戊巴比妥钠5ml/kg(腹腔注射)将大鼠麻醉后,腹部向下俯卧于实验台上,记录电极置于背恻中轴上,参考电极置于同一水平的皮下,两者相距1cm,接地电极位于记录电极和刺激电极的腹部,刺激电极位于大鼠腓肠肌中,阴阳电极相距1cm,刺激大鼠下肢周围神经,在大脑皮质体感区或脊髓的不同节段记录SEP。刺激强度以爪出现轻微抽动为宜,观察电位潜伏期、波幅的变化、脊髓损伤及神经传导通路功能恢复情况。每次测试均重复两次,确保结果准确性。1.2.4免疫组化试剂盒一抗(RabbitAnti-BDNF;RabbitAnti-SLIT2)购自武汉博士得公司;SP-9000Histostain-PlusKits免疫组化染色试剂盒订购自北京中杉金桥生物技术公司。常规脱蜡至水。馏水冲洗,PBS浸泡5min。3%H2O2去离子水孵育5~10min,滴加试剂A室温孵育10~15min,滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2~3h或4℃过夜。滴加试剂B,室温或37℃孵育10~15min。PBS冲洗,3min×3次。滴加试剂C,室温或37℃孵育10~15min。PBS冲洗,3min×3次。选择适当的封片剂封片。1.3细胞系统检测采用JD-801病理图像分析系统,各组每只大鼠取5张切片,随机视野中阳性反应细胞测其灰度值,每张片随机取5个视野,取其均值作为每1例的平均灰度。数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和组间比较q检验法。应用SPSS11.5软件进行统计学分析。2结果2.1基本规则及其显著性差异SCI后,BBB评分呈逐步上升趋势,7天组较前明显上升,有显著性差异;SCI后SEP波幅即增大,然后逐步减少(表1)。与正常组、假手术组比较,*P<0.01,**P<0.05,与前一组比较,#P<0.01,##P<0.05。2.2灰质神经元损伤后比较损伤后1天组,灰白质出血明显、灰质内神经元部分消失。损伤后3天组灰质内神经元变性、白质内神经节细胞明显减少,灰白质界限不明显,部分区域可见炎细胞浸润。损伤后5天组可见较多组织细胞,炎细胞减少。灰质神经元变性与前一样。损伤后7天组灰质内神经元增多,白质内仍有大量组织细胞反应,有新生小血管。损伤后14天组变性轻,可清楚见神经元轴树突。损伤后21天组灰质基本正常、白质可见少量组织细胞。损伤后28天组灰白质界限很明显,几乎同正常。正常组和假手术组:脊髓硬膜外可见灶性中性粒细胞浸润和少量出血,灰白质无变化。2.3不同时间组nf表达变化BDNF免疫反应阳性产物主要分布在脊髓灰质前角,呈棕黄色或红棕色阳性颗粒.1天内即升高,3天达高峰,5天组仍处于较高水平,14、21天未显示,28天组表达再次升高(表2,图1)。slit-2阳性反应物为棕黄色颗粒,正常对照组和假手术组有散在低度表达,SCI后上升,3天达高峰,slit-2阳性颗粒广泛分布于整个脊髓灰质区域内,但以前角运动柱较为集中,表达量与假手术组有显著性差异(表2,图2)。与正常组、假手术组比较,*P<0.01;与前一组比较,#P<0.01,##P<0.05。A:1天组;B:3天组;C:5天组;D:28天组。图1大鼠脊髓损伤后不同时间组BDNF的表达变化(免疫组化,×200)Fig1TheexpressionchangesofBDNFinangulusanteriormotorindifferentphasesafterSCI(immunohistochemicalanalysis,×200)A:1天组;B:3天组;C:5天组;D:28天组。图2大鼠脊髓损伤后不同时间组slit-2的表达变化(免疫组化,×200)Fig2TheexpressionchangesofSlit2inangulusanteriormotorindifferentphasesafterSCI(immunohistochemicalanalysis,×200)3slit和sevit的同步表达中枢神经的再生修复一直是神经科学界研究的热点。如何有效促进SCI后神经再生,成为实验研究、临床治疗和康复的关键。BDNF是德国神经生物学家Barde于1982年首先从猪脑中提取纯化的一种碱性蛋白质,在成年人BDNF可存在于脊髓组织中的各型细胞,包括前角的运动神经元以及侧角和后角的各型神经元及轴索和胶质细胞。SCI后脊髓神经元和轴突仍具有一定的再生能力,但这种再生需要有神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)的营养支持。BDNF作为一种保护性NTFs,参与SCI后的复杂病理过程,通过为损伤神经元提供营养而挽救损伤的运动神经元和感觉神经元。SCI后,BDNF在损伤局部的升高,可以促进脊髓神经元和轴突的再生。在SCI早期,BDNF主要由神经元和星形胶质细胞合成,而晚期BDNF主要由小胶质细胞/巨噬细胞分泌,前者对损伤的脊髓起神经保护作用,后者则促进神经轴突的修复,起神经趋向性作用,其表达与损伤时间的延长具有明显的相关性,而其实验结果的不甚相同表明不同损伤程度和损伤方式可能会对内源性BDNF基因的表达产生不同的影响。slit是新近发现的第一种对轴突生长和神经元迁移都有导向作用的导向因子,由胚胎脊髓联合纤维发育期中枢中线底板处星形胶质细胞分泌,有slit1,2,3等几种亚型,其中slit-2在脊髓广泛表达。哺乳动物中的slit基因包括人类hslits的和大鼠的rslit,它们之间有60%以上的同源性。本实验证实,在成年大鼠SCI急性期BDNF和slit-2呈一过性同步表达增高,并且BDNF增高要略早于slit-2,主要在损伤脊髓前角表达,提示BDNF参与前角运动神经元的生理活动;而slit-2随后增高则说明受损脊髓局部也存在slit的再次分泌,这应该是星型胶质细胞反应性增生的一种表现并对轴索再生产生重要作用。slit在中枢神经中线通过Robo介导对轴突的排斥反应。slit-2在损伤脊髓前角、中央管和后角的不均分布提示其对再生轴突的推斥性引导先主要是在前角运动柱出现。BDNF1天内即升高,3天达高峰,14、21天未显示,28天再升高,这双向变化趋势与有关实验结果相符。slit-2SCI后即升高,3天达高峰,然后逐步减少。两者均在脊髓前角表达较明显,提示可能与后肢体运动功能修复相关。本实验光镜下细胞形态观察显示了SCI后脊髓血肿吸收、自然修复的一个过程。对SCI后的大鼠进行BBB评分发现随着时间的推移,BBB评分呈升高的趋势,说明内源性BDNF表达增加与脊髓损伤修复有关。SEP主要由后索、脊髓小脑束及脊髓丘脑束等共同传导,SEP的改变能反映脊髓感觉传导通路的功能状态。波幅的大小是由特定的皮质感觉区内兴奋的神经元数目的多少来决定的。本实验在脊髓损伤时波幅明显增大(大于正常组),7天后明显减小。前者是由于机械刺激对脊髓