中枢神经系统nogo基因的研究进展

中枢神经系统nogo基因的研究进展

在中枢神经系统中，三种类型的蛋白质位于少突胶质细胞中，这促进了成熟中枢神经系统的金元轴突再生。NgR是Nogo-A,髓鞘相关糖蛋白,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白的受体,是一种糖基醇磷脂结合蛋白,位于神经元表面。对Nogo蛋白及其受体NgR的认识研究,对了解其在中枢神经系统不同发育时期的生物学功能及中枢神经系统修复研究有重要的意义。1nogo-66基因成年哺乳动物外周神经系统损伤后可有效再生,但中枢神经系统损伤后,受损神经元轴突的再生能力却极为有限,从而丧失功能。一直以来,人们通过不断的探索发现3种神经轴突生长抑制因子,这3种蛋白分别是:Nogo髓鞘相关蛋白(Nogo-A),髓鞘相关糖蛋白,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白。其中,Nogo-A可能是阻止中枢神经再生的关键因素。1.1Nogo-A有学者发现,将成年大鼠脊髓背根神经节细胞移植到脊髓灰质后可延伸轴突,但若将其移植到白质中,轴突就不能再生,这说明脊髓白质可产生轴索生长抑制物。研究小组从分化的少突胶质细胞中成功分离出一种抑制蛋白,命名为Nogo蛋白,意思是:“NoGoforNeuron”,并研制了对相对分子质量为35×103(NI35)和250×103(NI250)的蛋白有很强的抑制作用的单克隆抗体,称为IN-1。Spillmann等对牛的一种抑制性蛋白中6个肽段序列的研究,发现该蛋白能和IN-1结合。根据这6个肽段的研究,Chen等在2000年成功地克隆了Nogo基因。Nogo-A含有1163个氨基酸,相对分子质量为126×103,富含酸性氨基酸和脯氨酸,含有一个由1024个氨基酸残基组成的的胞外结构域,7个N-糖基化位点和多个O-糖基化位点,2或3个跨膜结构域和1个短的胞内域。氨基端有172个氨基酸序列,没有亲水的信号序列,蛋氨酸是其起始序列,羧基端由188个残基组成,包含两个疏水结构域(35个和36个氨基酸),二者被一包含66个残基的亲水结构域(Nogo-66)分开。羧基端有个双赖氨酸的内质网定位信号。Nogo-A全长存在两个抑制性功能域:一个是位于胞外的Nogo-66,另一个是胞内的氨基端(Amino-Nogo)。成年哺乳动物中Nogo-A主要分布于中枢神经系统少突胶质细胞内质网。只有极少量位于少突胶质细胞表面,在某些神经元膜上或细胞内也有表达,但在Schwann细胞和星形胶质细胞中未见分布;外周组织中,仅睾丸和心脏中有少量分布。1.2Nogo-66受体(NgR)2001年,Fournier等运用碱性磷酸酶融合技术发现了Nogo-66的受体(NgR)。NgR是一种富含亮氨酸的脑特异性蛋白,此蛋白质包含473个残基,氨基端有一信号肽,其后为8个富含亮氨酸的重复区,羧基端含丰富的半胱氨酸,与糖基化磷酸肌醇相连与神经元的结合具有高亲和性和可饱和性,与可溶性Nogo-66具有高度亲和性,NgR正是借助于糖基化磷酸肌醇才得以固定在神经元细胞膜表面上。Nogo-66受体(NgR)包括三个亚家族:NgR、NgRH1和NgRH2。NgR亚家族有6个诊断性残基,其中4个是衍生性的,NgRH1蛋白有7个诊断性残基,都是衍生性的,而NgRH2蛋白共有8个诊断性残基,其中有7个是衍生性的。已公布的NgR结构图谱揭示,21个诊断性氨基酸残基中有18个是暴露于表面的,定位于NgR外功能区的顶部和底部。NgR在中枢神经系统中分布广泛,灰质中含量较高,大脑皮层、海马、脑桥、小脑蒲肯野细胞也有分布,但不存在于少突胶质细胞。外周组织中,只有心脏和肾脏有极少量的分布。目前,Nogo-A及其受体NgR在神经损伤方面的研究已经取得了长足的进步。Nogo-A是主要由少突胶质细胞表达的整合膜蛋白,在体内和体外都表现出强烈的抑制轴突生长的作用。NgR已明确为Nogo-66的受体,研究也证实NgR的拮抗剂能促进轴突再生。制备出的IN-1,已经证实明显促进受损的中枢神经系统轴突生长和功能恢复。研制出的NgR竞争性拮抗剂NEP-40(Nogo细胞外多肽,1～40残基),体外使用后也取得了相似的结果,并且对亚急性中枢神经系统损伤也有治疗效果。Liebseher等报道IN-1可以促进中枢神经轴突的侧向发芽生长。切断2～6周龄大鼠皮质脊髓束后将IN-1单抗杂交瘤细胞移入脑内,在损伤处见到明显的神经出芽。而Fischer等将小鼠Nogo受体阻断后发现,视神经再生较正常小鼠有明显的提高。此外,研究还发现,Nogo-A是一种支配实验性白身免疫性脑脊髓炎及多发性硬化发展进程的重要因素,与中枢神经自身免疫性脱髓鞘作用密切相关。2缺少添加nogo-66的信号转导因子大量实验证实,Nogo-A是中枢神经系统髓磷脂神经元轴突生长抑制因子。依据如下:①Nogo-A主要存在于中枢神经系统髓磷脂和少突胶质细胞中;②Nogo-A抑制背根神经节神经元轴突生长及小鼠成纤维细胞(3T3成纤维细胞)延伸;③单克隆抗体IN-1可中和Nogo-A的轴突生长抑制作用,促进损伤后神经元轴突再生。Nogo-A长的氨基端及Nogo-66均有很强的轴突生长抑制作用。Nogo-66主要嵌合于轴突髓鞘及少突胶质细胞表面,再生轴突生长锥表面存在Nogo-66的特异性受体NgR。Nogo-66与NgR复合物结合后即发挥轴突再生抑制并导致轴突生长锥变性萎缩的功能。中枢白质中尚未发现NgR_mRNA,而白质的少突胶质细胞却表达Nogo-A。存在于中枢白质的Nogo-A与分布于中枢神经元(灰质)的NgR通过特异性的配体受体式结合,使原先对Nogo-A并不敏感的中枢神经元具有对Nogo-A较为敏感的反应性,从而表现出Nogo-A对中枢神经的抑制活性。Nogo-A抑制神经元轴突再生可能通过以下3种方式:①细胞-细胞方式,即完整少突胶质细胞表面的Nogo-66与损伤神经元的NgR结合;②细胞-膜方式,即从受损少突胶质细胞脱落下来的含Nogo-66的膜片段与损伤神经元的NgR结合;③完全溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,与其受体结合,抑制作用更强。NgR缺乏跨膜区域,因此需要复合受体参与信号转导。近年来,研究鉴定的两个复合受体成分神经营养因子低亲和力受体p75(p75NTR)和Lingo-1中,p75NTR缺陷大鼠髓鞘相关糖蛋白对神经再生抑制和RhoA激活的削减暗示p75NTR可能在NgR通路起作用。两个实验组的研究显示,p75NTR可能是p75的复合受体并互相结合,而且p75NTR为Nogo,髓鞘相关糖蛋白,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白抑制活性所必需。然而有免疫组化数据显示,p75NTR仅仅在神经元的极小的亚单位表达,而且功能性p75NTR缺失或局部注入p75NTR可结晶片段分子并不能促进脊髓损伤后轴突再生,这提示p75NTR不是介导体内髓鞘衍生抑制因子功能的关键分子。另一种命名为Lingo-1的富亮氨酸蛋白是NgR信号转导复合物的第三种组成成分。外源性加入可溶性Lingo-1可结晶片段蛋白(包含LINGO-1分子胞外段LRR和IgC2结构域的可结晶片段融合蛋白)减轻髓鞘衍生抑制因子对神经元的抑制效应,这提示Lingo-1是NgR-p75信号转导复合物的功能成分。Park等研究发现,TROY(肿瘤坏死因子TNF受体家族成员)在成年神经系统选择性的表达,能与NgR和Lingo-1形成受体复合物介导髓鞘抑制效应,而且可溶性TROY蛋白能有效阻止抑制效应,成年神经系统再生失败可能与此有关。Nogo-A与其受体结合后,小鸟嘌呤核苷三磷酸酶的Rho家族成员-rho、rac、cdc42及内源性第二信使在其信号转导过程中发挥了重要作用。用神经营养因子提高神经元内cAMP水平,激活蛋白激酶A,使Rho磷酸化而失活,可以阻断髓磷脂对轴突生长的抑制作用。细胞内游离钙也与生长锥延伸和收缩过程密切相关。Nogo-A导致生长锥溃变之前,细胞内Ca2+浓度明显升高。Ca2+与钙调蛋白结合后,激活蛋白激酶,也可以导致Rho磷酸化而失活,促进生长锥延伸。因此可以认为,中枢神经系统神经元损伤后,溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,与其特异性受体复合物结合,通过第二信使作用于Rho,对生长锥中的微丝进行调节,使生长锥溃变,抑制轴突再生。Shao等发现,在神经元缺乏p75蛋白时,一种叫TAJ的肿瘤坏死因子家族的受体可结合Nogo-66受体,而替代p75/Nogo-66受体/Lingo-1复合物激活RhoA,表现髓鞘的抑制轴突生长作用。以上的研究表明,NgR受体复合物是由Lingo-1/NgR/p75/或Lingo-1/NgR/TAJ(TROY)构成。除上述机制外,Nogo-A还对轴突生长相关基因有下调作用。轴突再生需要受损神经元上调某些与生长相关的基因,如c-jun、iunD、gap-43等。上述基因的表达上调或许由于神经元去除了某些来自轴突的抑制信号,Nogo-A可能是其中之一,因为使用IN-1后,细胞生长相关基因表达上调,轴突再生明显。此抑制作用的细胞内信号转导机制目前尚不清楚。3轴突生长抑