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文档简介
PAGE《细胞生物学》教案 (第16次课2学时) 一、授课题目第九章细胞核与染色体(Nucleusandchromosome)二、教学目的和要求1.熟练掌握核被膜的形态结构与功能;2.理解核基质的功能,核仁的结构与功能;3.掌握染色质的结构组成与装配,染色体的形态结构。三、教学重点和难点教学重点:1核膜及核孔复合体2染色体的空间结构教学难点:核孔复合体与核仁的结构与功能四、主要参考资料翟中和.细胞生物学,第三版.北京:高等教育出版社,2007五、教学过程细胞核的基本概况发现1781年Trontana发现于鱼类细胞;1831年,Brown发现于植物。二、形态、大小、数目、分布1形态间期细胞核形态多样,一般为圆形或卵形。其形态与生物的种类、细胞的形状、细胞类型、发育时期以及机能状态有关。2大小多数细胞核在5—30μm。小的不到1μm,大的可达500—600μm(苏铁科某植物的卵细胞核)。通常:低等生物1—4μm;高等动物5—10μm;高等植物5—20μm;常以核质比来估算核的大小。正常细胞NP≈0.5,分裂期细胞NP>0.5,衰老细胞NP<0.5。3数目通常一个细胞只有一个核,也有两个以上的多核现象及在某一发育时期的无核现象。成熟的筛管和红细胞(0)、肝细胞、心肌细胞(1-2)、破骨细胞(6~50)、骨骼肌细胞(数百)、植物毡绒层细胞(2~4)。(筛管:高等植物韧皮部中的管状结构。由筛分子组成,负责光合产物和多种有机物在植物体内的长距离运输。)4分布细胞核多位于细胞中央,但也有各种不同情况,如上皮细胞的核偏于基底侧;横纹肌的细胞核靠近质膜;植物细胞成熟后若有较大液泡,核则被挤在一边。三、细胞核的结构在固定和染色的细胞中,可观察到间期细胞核有下列结构:核被膜(nuclearenvelope)、核纤层(nuclearlamina)、染色质(chromatin)、核仁(nucleolus)、及核基质(nuclearmatrix)组成。四、细胞核的功能1.遗传:通过染色体DNA的复制和细胞分裂,维持物种的世代连续性;2.发育:通过调节基因表达的时空顺序,控制细胞的增殖分化,完成个体发育使命。(细胞核的结构)(GwenaelRetal(2004)Dynamicsofnuclearporecomplexorganizationthroughthecellcycle.CurrentOpinioninCellBiology16:314-321)(小鼠肝细胞细胞核;超薄切片在透射电镜下观察;细胞核上面挨着细胞核的是线粒体;细胞核有双层膜;细胞核内是核基质;染色较深的是异染色质(he,包装程度比较高);染色较浅的是常染色质(eu);细胞核的核仁(nu);核孔复合体(NP))(模式图;外膜与内质网的膜相连;核间隙与内质网腔相通;核孔复合体nuclearporecomplex;内膜内侧红色的部分是核纤层nuclearlamina(构成核纤层的是核纤层蛋白,核纤层蛋白是一种中间纤维);这些物质的机械支撑作用,有利于细胞核中遗传物质的存在;(几个问题?=1\*GB3①假如一个蛋白质既编码了核定位信号序列又编码了内质网定位信号序列,此蛋白应该定位在哪里?(结合蛋白质分选的内容,信号序列分别在什么时候发挥作用)=2\*GB3②内质网信号序列在进入内质网后要被切除掉,而核定位信号序列是否也要被切除?如果不切除有什么生物学意义=3\*GB3③外核膜上含有大量的核糖体颗粒,是一种附着核糖体,与在内质网上膜的核糖体是一样的,也在进行翻译蛋白质,这些蛋白质是进入内质网还是进入细胞核?)(nucleusofaculturedhumancell;红色的一圈是核纤层,用其特异性的抗体;xenopusoocyte爪蟾卵extractedwithTritonX-100;核纤层相互编织)(核纤层的功能:为核被膜提供支撑;为细胞核中的染色质提供附着位点)有关核纤层的补充:核纤层(nuclearlamina),是位于内核膜内侧的一层纤维纵横排列整齐的网络状纤维蛋白质片层,厚度随细胞不同而异。核纤层与中间纤维、核骨架相互连结,形成贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系。它位于内层核膜与染色质之间,与核膜、染色质及核孔复合体在结构上有密切联系。核纤层在某些细胞中形成连续的层,而在有些细胞中则形成一段一段的网络结构。核纤层蛋白向外与内层核膜上的蛋白结合,向内与染色质的特定区段结合。三种类型的核纤肽都以二聚体的形式存在,有球形的头部和尾部结构域及一个杆状的α-螺旋中心。这些核纤肽二聚体以头-头、尾-尾相接的方式形成纵横排列整齐的纤维网络状。核纤层结构核纤层由核纤肽(lamin)构成,核纤肽是一类中间纤维蛋白(多肽),有laminA、laminB和laminC三种类型,分子量60~80KD。laminA的C末端比laminC的C末端多133个氨基酸残基。laminB在羧基端多了疏水的异丙基,异丙基能帮助laminB插入到核膜的内脂层。核纤层的作用:1维持细胞核的形态核纤层是核被膜的支架,此外,核纤层与核骨架以及穿过核被膜的中间纤维相连,使胞质骨架和核骨架形成一连续网络结构。2提供染色质附着位点在间期核中核纤层提供染色质(异染色质)在核周边锚定的位点。核纤层能与染色质的特定区段结合。内核膜上具有laminB的受体(为8次跨膜蛋白),以及emerin蛋白(为单次跨膜蛋白)等膜整合蛋白,能与核纤层蛋白结合。3参与染色质和核的组装核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化。在前期结束时,核纤层被磷酸化,介导核膜解体。其中laminB与核膜残余小泡结合,A型溶于胞质中。在分裂末期,核纤肽去磷酸化重新组装,介导核膜的重建。第一节核被膜与核孔复合体一、核被膜(nuclearenvelope)亦称核膜(nuclearmembrane),由此使遗传物质DNA与细胞质分开。电镜下证实为双层单位膜呈同心性排列。除两膜之间有间隙外,膜上还有些特化结构。所以,认为核被膜含义深刻,包括内容多,并执行重要的生理功能。核被膜结构1外层核被膜(outernuclearmembrane,ONE)(外核膜)膜厚6.5—7.5nm,相邻细胞质的一面常有核糖体附着,并有时与内质网(RER)相连,因此显得粗糙不平。2内层核被膜(innernuclearmembrane,INE)(内核膜):膜厚度基本同ONE,膜上无核糖体附着,显得比ONE平滑。但在其内表面常附有酸性蛋白质分子的聚合物组成的纤维网状结构(密电子物质),称纤维层(fibrousLamina)或核纤层(nuclearlamina),又有内致密层之称。其厚度约在10—20nm(30—160nm),是位于细胞内核膜下的纤维蛋白或纤维蛋白网络。3核周间隙(perinuclearspace)又有核围腔或核围池之称。指两膜之间的空隙,宽约20—40nm(10—50nm),内充满液态无定形物质(蛋白质、酶类、脂蛋白、分泌蛋白、组蛋白等),它是核质之间活跃的物质交换渠道(有些部位直接与ER或Golgi池相通)。4核孔(nuclearpore)核膜并不完全连续,在许多部位,核膜内外两层常彼此融合,形成环状孔道,称为核孔,它们是核质之间的重要通道。(核被膜的结构组成)(二)核被膜在细胞周期中的崩解与装配核膜在细胞周期的不同时期,有相应的变化方式。在S期:表面积有增大趋势;在间期:表现出周期性崩解(前期末)消失,重建(末期)过程。(Breakdownandreformationofnuclearenvelopeduringmitosis;=1\*GB3①Thephosphorylationofthelaminstriggersthedisassemblyofthenuclearlamina,whichinturncausethenuclearenvelopetobreakupintovesicles.Dephosphorylationofthelaminshelpsreversetheprocess.=2\*GB3②Becausethenewnuclearenvelopeissocloselyappliedtothesurfaceofthechromosomes,itexcludesalloftheproteinsinthecellexceptthoseboundtothechromosomes.Sonuclearlocalizationsignalsarenotcleavedoffaftertransportintothenucleus.=3\*GB3③Oldnuclearenvelopereformsnewnuclearenvelope)(当细胞从间期进入有丝分裂的时候,核被膜解体,原因是因为核被膜下的核纤层蛋白被细胞周期里面一些蛋白激酶磷酸化,使得原来编制有序的核纤层解体,附着在上面的核被膜就会崩解,然后以膜泡的形式存在,遗传物质染色体进入细胞两级后,核被膜开始装配,就形成两个子细胞的细胞核)(子细胞的核被膜来自于原有的核被膜;通过变形虫做实验,将变形虫细胞培养在磷脂酰胆碱的前体物胆碱,即带3H标记的胆碱培养基,在核被膜、内质网膜、质膜都能标记上(因为膜脂分子合成在内质网,内质网与外核膜是连续的,内质网可以出芽到高尔基体,高尔基体可以出芽到质膜),将带3H标记的细胞核放入另一个不带3H标记的去核的变形虫细胞中,发现有丝分裂后,一分为二的子细胞核内,均有3H标记,且同位素数量减半,说明新的子细胞的核被膜来自于老的核被膜)(但是子细胞的细胞核膜仅仅只是来自于老的核被膜吗?)二、核孔(nuclearpore)现多称核孔复合体(nuclearporecomplex,NPC)核孔直径通常在70—80nm或更大(80—120nm),70nm为常见,通道直径只有9nm。核孔数目在各细胞有所不同,一般占膜面积的8%。代谢旺盛,分化程度低,转录活动强的细胞,数目多,密度大。如两栖类处于灯刷染色体阶段和卵母细胞,密度可达35—65/μm2,总数达30×106个,而同一个体(两栖类)的成熟红细胞密度只有3个/μm2,总数只有150—300个。一般哺乳动物细胞平均有3000个核孔。核孔由至少50种不同的蛋白质(nucleoporin)构成,称核孔复合体(nuclearporecomplex,NPC)。(一)结构模型对核孔复合体结构的解释有:纤丝模型、捕鱼笼式模型、圆柱状模型等。1纤丝模型(Franke&Scheer1974)在内外口边周有密电子的环状物质存在,称为环带,环带不是匀质的,其结构包括孔环颗粒(annulargranules):在内、外口周缘各排列有8个对称的、直径约10—25nm的球状颗粒,即孔环颗粒。孔环颗粒本身是由微细粒子和纤丝相盘绕而成。纤丝可分别在核被膜的核质面和胞质面与细胞核、细胞质中的基质蛋白相连甚至可以伸出很多(20—60nm)。中央颗粒(centralgranules)中央栓:在核孔中央有一粒状或棒状的颗粒,称中央颗粒,直径约5—30nm,并不充满整个核孔。中央颗粒有纤丝与孔环颗粒及周围孔壁相连,推测它与核孔的开闭有关。由于它具有核糖核蛋白体性质,在核质交换中起一定作用。所有人认为可能是由核内向胞质移动的核糖体前体一时附着于核孔,尚无定论。此外,还有辐(8个)、伸向核质,胞质的纤维等。2捕鱼笼式模型(滴漏样模型):在电镜下观察,核孔是呈圆形或八角形,现在一般认为其结构如fish-trap。此模型从横向看,从周边到核孔中心依次为环、辐、栓。从纵向看,由核外到核内依次为胞质环、辐(+栓)、核质环(核蓝),以及与核篮相连的“caber”网络。胞质环,又称外环。核质环则称为内环,向内形成捕鱼笼式的核篮。辐由核孔边缘伸向中心,呈辐射状八重对称,进一步分为柱状亚单位、腔内亚单位和环带亚单位。栓(中央栓或中央颗粒)“transporter”。胞质环(cytoplasmicring),位于核孔复合体胞质一侧,环上有8条纤维伸向胞质;②核质环(nuclearring),位于核孔复合体核质一侧,上面伸出8条纤维,纤维端部与端环相连,构成笼子状的结构;③辐(spoke):核孔边缘向核孔中央的伸出物。柱状亚单位;腔内亚单位;环带亚单位④转运器(transporter),核孔中央的一个栓状的中央颗粒;中央栓(centralplug),中央颗粒(centralgranule)3圆柱状模型(1992)。(在内外核膜相互融合的地方,有核孔,有很多蛋白质装配在这,称核孔复合体;图为深度蚀刻电镜照片;有很多梅花一样的装配在核膜上)(amodelfoavertebratemuclearporecomplex;molecularmass:~125million百万,兆;八重对称;胞质和核质八重非对称,保证了细胞核和细胞质的物质运输)化学成分核孔蛋白(nucleoporin,Nup)推测100余种不同的多肽,1000多个蛋白质分子,统称为核孔蛋白(nucleoporin,Nup)。已在酵母中鉴定到30余种,在脊椎动物中鉴定到10余种。Gp210位于孔膜区,功能包括:介导核孔复合体与核被膜连接;在介导核被膜融合形成复合体时起重要作用;在介导核质交换时起作用。p62是一类功能性的核孔蛋白,可能直接参与核质交换。Gp210:结构性跨膜蛋白质-介导NPC与核被膜连接-在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用-在核质交换中起作用P62:功能性Nup-疏水性N端区:具有FXFG重复序列-C端区:具有疏水性的7肽重复序列-可能直接参与核质交换F:苯丙氨酸G:甘氨酸(三)NPC的功能双功能、双向性的亲水性核质交换通道PassivetransportActivetransport三核纤层(nuclearlamina)3种核纤层蛋白:laminA、B、C核纤层蛋白本身形成纤维状网络结构(nucleusofaculturedhumancell;红色的一圈是核纤层,用其特异性的抗体;xenopusoocyte爪蟾卵extractedwithTritonX-100;核纤层相互编织)(核纤层的功能:为核被膜提供支撑;为细胞核中的染色质提供附着位点)有关核纤层的补充:核纤层(nuclearlamina),是位于内核膜内侧的一层纤维纵横排列整齐的网络状纤维蛋白质片层,厚度随细胞不同而异。核纤层与中间纤维、核骨架相互连结,形成贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系。它位于内层核膜与染色质之间,与核膜、染色质及核孔复合体在结构上有密切联系。核纤层在某些细胞中形成连续的层,而在有些细胞中则形成一段一段的网络结构。核纤层蛋白向外与内层核膜上的蛋白结合,向内与染色质的特定区段结合。(核纤层结构核纤层由核纤肽(lamin)构成,核纤肽是一类中间纤维蛋白(多肽),有laminA、laminB和laminC三种类型,分子量60~80KD。三种类型的核纤肽都以二聚体的形式存在,有球形的头部和尾部结构域及一个杆状的α-螺旋中心。这些核纤肽二聚体以头-头、尾-尾相接的方式形成纵横排列整齐的纤维网络状。laminA的C末端比laminC的C末端多133个氨基酸残基。laminB在羧基端多了疏水的异丙基,异丙基能帮助laminB插入到核膜的内脂层。)核纤层的功能:结构支撑功能调节基因表达调节DNA修复与细胞周期有关1维持细胞核的形态核纤层是核被膜的支架,此外,核纤层与核骨架以及穿过核被膜的中间纤维相连,使胞质骨架和核骨架形成一连续网络结构。2提供染色质附着位点在间期核中核纤层提供染色质(异染色质)在核周边锚定的位点。核纤层能与染色质的特定区段结合。内核膜上具有laminB的受体(为8次跨膜蛋白),以及emerin蛋白(为单次跨膜蛋白)等膜整合蛋白,能与核纤层蛋白结合。3参与染色质和核的组装核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化。在前期结束时,核纤层被磷酸化,介导核膜解体。其中laminB与核膜残余小泡结合,A型溶于胞质中。在分裂末期,核纤肽去磷酸化重新组装,介导核膜的重建。Hutchinson-GilfordProgeriaSyndrome(HGPS)早年衰老综合征,简称早老症早年衰老综合征,简称早老症,呈散发的常染色体显性遗传,他是过早老化疾病中的一种典型病例,被认为是研究正常衰老进程的一个模型,患者多为儿童,发病率为1/800万患儿衰老速度相当于正常儿童的5-10倍,刚出生时患儿看似正常,但到一两岁时,早老的症状就开始出现,主要表现为严重生长迟缓,秃顶,皮下脂肪缺失,硬皮症,特征性颅面异常,手指关节变硬,骑马样姿态,像个小老头,但思维和认知状况正常,是一种部分衰老综合征;随后出现加速的动脉粥样硬化,充血性心力衰竭,心肌梗死等严重症状。患儿大多死于心血管疾病或中风,寿命大多为7-27岁,平均为13岁。发病机理:由于编码A/C型核纤层蛋白的laminA基因发生点突变而引起的,这个突变激活了基因11号外显子上一个隐蔽的剪切位点,产生了一种被截短了C端的50个氨基酸的A型核纤层蛋白sporadic四核被膜的主要功能1构成核质之间的天然选择性屏障核被膜为内膜系统的组成部分,是将DNA局限在细胞核的关键结构,使细胞功能区域化。(避免生命活动的彼此干扰,使生命活动更加井然有序;保护DNA不受细胞骨架运动所产生的机械力的损伤)2核质间物质交换与信息交流通过膜的物质运输:(1)部分离子、水分子、100道尔顿以下的小分子(单糖、双糖、āā、核酸、组蛋白、RNA聚合酶、DNA聚合酶等)可以自由通过核膜;(2)有些大分子物质常以小泡形式排出核外(内膜局部先形成小泡,移向外膜,融合后排出,另外方式是物质先进入核周腔,然后经外膜外排或进入与核周腔相通的内质网腔。通过核孔复合体的物质运输:核孔复合体可看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体,构成核质间双功能、双向选择性运输的通道,双功能分为被动运输和主动运输。双向性为介导入核和出核转运。(通过核孔复合体物质运输的功能示意图)自由扩散:~9nm;~5000D(fast);17,000D(2min);>60,000D(х)被动扩散:功能直径约9—10nm,甚至12.5nm,允许离子、水溶性分子、代谢物小蛋白分子穿梭于核—质之间,进行自由扩散和协助扩散;扩散速度与分子量成反比。小于5×103的可自由进入,大于60×103的球蛋白不能进入。主动运输:对进出核的物质具高度选择性。表现在(1)对运输颗粒大小的选择,一般可达10-20nm,有效直径可调节;(2)是一个信号识别与载体介导的过程,需要ATP;(3)具有双向性。爪蟾卵母细胞核质蛋白注射实验入核是否由分子大小决定呢?(Pentamer五聚体将非核蛋白和核质蛋白/核浆素nucleoplasmin分别注射到细胞质基质当中,结果发现,非核蛋白始终在细胞质基质当中,核浆素很快进入细胞核中,说明蛋白质的核输入是有选择性的,需要核定位信号序列,即蛋白质自身的氨基酸序列;)(主动运输;Transportoflargeproteinsintonucleusneedsnuclearlocalizationsignal(NLS))(将非核蛋白和核质蛋白/核浆素nucleoplasmin分别注射到细胞质基质当中,结果发现,非核蛋白始终在细胞质基质当中,核浆素很快进入细胞核中,说明蛋白质的核输入是有选择性的,需要核定位信号序列,即蛋白质自身的氨基酸序列;)(核定位信号在蛋白质的什么部位?P316用核质蛋白做实验,核质蛋白有头部结构域和尾部结构域,通过有限的蛋白水解,分成头部和尾部,用放射性标记完整核质蛋白、头部、尾部,注射到细胞质基质中,头部没有进入细胞核,而尾部进入了细胞核,说明尾部有核定位信号,或者将尾部耦联上胶体金颗粒,也可以进入细胞核)(是否可以用GFP做融合蛋白?不可以,因为在荧光显微镜下只能看到是在核还是细胞质,不能看到是否通过的是核孔复合体)信号与Ran蛋白核定位信号(NLS):引导蛋白进入细胞核,受体为improtin,4-8个氨基酸组成,含Pro、Lys和Arg。完成核输入后不被切除第一个被确定的NLS是猴肾病毒SV40的T抗原,其NLS为:-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val-核输出信号(NES):引导RNP输出细胞核,受体为exportinRan蛋白:属G蛋白,调节货物复合体的解体或形成(ColloidalgoldlabeledNucleoplasminweretransportedintonucleus.)(发现的第一个有核定位信号的蛋白质是SV40肉瘤病毒40;Normalpyruvatekinase:incytosol;ChimericpyruvatekinasecontainingSV40NLS:innucleus;NLS(fromSV40Tantigen)-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val-大多数是碱性氨基酸)(可以将SV40改造后变成载体,信号序列可以连接到丙酮酸激酶上,正常情况丙酮酸激酶是定位在丙酮酸激酶中,细胞核没有荧光,而融合了SV40的丙酮酸激酶在细胞核产生荧光,因此核定位信号可以将非细胞核蛋白引导进入细胞核;(如果将核定位信号的赖氨酸定点突变边成苏氨酸,则此核定位信号就失去它的作用)进核物质(核输入):复制、转录、染色体构建、核糖体组装等所需因子及酶运至核内。亲核蛋白的核输入:此类蛋白质一般含有特殊的氨基酸信号序列,称为核定位信号(NLS),存在于亲核蛋白的功能区域,对蛋白质进入核起“定向”“定位”的作用,从而保证整个蛋白质通过核孔的核输入。NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位,可以是连续的或不连续的,指导进入核后也不被切除。核质蛋白(nucleoplasmin)的C端有一个信号序列,可引导蛋白质进入细胞核,称作核定位信号(nuclearlocalizationsignal)。NLS由4-8个氨基酸组成,含有Pro、Lys和Arg。对其连接的蛋白质无特殊要求,并且完成核输入后不被切除。核孔选择性运输还需要一些胞质蛋白因子辅助。其中imporin负责将蛋白从细胞质运进细胞核,exportin负责相反方向的运输。通过核孔复合体的转运还涉及Ran蛋白,Ran是一种G蛋白,调节货物受体复合体的组装和解体。亲核蛋白入核的运输步骤①亲核蛋白与NLS受体(imporinα/β二聚体)识别并结合为复合物;②转运复合物与核孔胞质环上的纤维结合;③转运器构象发生改变,转运复合物通过核孔;④转运复合体与核质中的Ran-GTP结合,复合体解散释放出货物;⑤与Ran-GTP结合的imporinβ,输出细胞核,在细胞质中Ran-GTP水解,Ran-GDP返回细胞核重新转换为Ran-GTP;⑥imporinα在核内exportin的帮助下运回细胞质。(importingproteinsfromthecytosolintothenucleus;bindtoreceptor→bindtocytoplasmicfilament→movethroughpore→interactwithRan-GTPanddissociate→receptorbacktocytosol)(NLS蛋白与胞质中的受体结合后,胞质纤维将复合体捕获,送进核孔复合体,转运到细胞核中,被转运物质的释放依赖于细胞核中的一种单体G蛋白,ran-GTP与importinβ结合,被转运物质释放到细胞核中,ran-GTP与importinβ(即受体)又返回到胞质中(出核)(此过程中核输入是单向的,首先是因为核孔复合体的非对称性,另一方面在很大程度上取决于ran-GTP酶的浓度梯度)(TheRanGTPasedrivesdirectionaltransportthroughNPC;核孔复合体的不对称性和Ran-GTP/Ran-GDP的浓度梯度)(在细胞核当中Ran-GTP的浓度比胞质当中高,胞质但中主要是Ran-GDP(是由于胞质中Ran-GAPG蛋白活化蛋白催化导致Ran-GTP水解),再进入细胞核通过鸟嘌呤交换因子Ran-GEF的作用下释放Ran-GDP重新结合Ran-GTP)出核物质(核输出):各种RNA、核糖体亚单位。引导RNP输出细胞核,受体为exportin。RNA的核输出是一种具有高度选择性的信号指导的过程。例mRNA及U1snRNA的5’端m7G帽子结构是二者核输出的关键,此现象称作帽结合活性。此外,RNA无论在核内还是核外,都是以RNA–蛋白质复合体形式存在,RNA的出核实际上是RNA-蛋白质的出核,蛋白质分子上可能有出和出核信号,称核输出信号(NES)。(hnRNPproteinscontainanuclear-exportsignal(NES)Reference:Cell92:327,1998;currentopinionincellbiology,2006,18:299-306)NPCmediatesbidirectionalnucleocytoplasmictrafficking(亲核蛋白通过NPC的转运)3作为酶分子的支架核膜上富集大量酶系(约50种),以膜蛋白形式镶嵌在核膜的磷脂分子层中,彼此保持一定的间距和组合,使各种生化反应有序进行,并进行彼此间的正、负反馈调节。4作为基因调控的阀门核膜可能参与DNA的合成及RNA前体的修饰。由于三种RNA分子要通过核孔进入胞质,所以核孔的启闭和孔径的变化,能直接有效地调节转录信息的流量。5在染色质(体)的定位及细胞分裂时发挥作用染色质的终未细丝常常连接在核孔上,这有助于解释为何非常复杂的染色质在异常活跃的细胞核内不致紊乱。6具有某些生物合成之功能核膜上附有核糖体,可进行蛋白质的合成。第二节染色质(Chromatin)和染色体(Chromosome)在真核细胞核中,遗传物质的储存形式,例如DNA并不是单独裸露存在的,它是与其他蛋白结合以染色质或染色体的形式存在。=1\*ROMANI一、概念及化学组成1842年,Nali在植物细胞核中发现了杆状的染色体。1848年,Hofmeister从鸭跖草的小孢子母细胞中发现染色体。1879年,W.Flemming提出了染色质(chromatin)。1888年,Waldeyer正式定名为Chromosome。(一)概念1染色质这个概念最初是在1879(1882)年由Flemming提出的,其含义是指细胞核内易被碱性染料染色的物质,是由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构(比例:1:1:(1:1.5):0.05),是间期细胞遗传物质存在的形式。(间期细胞中;分散于整个细胞核当中;呈纤维状;直径是10-30nm)2染色体1888年,Waldeyer提出。染色质在有丝分裂时高度螺旋化形成染色体,所以染色体是指在细胞分裂时,由染色质凝集而成的棒状结构。即由DNA、组蛋白、非组蛋白等所形成的特定形态结构。(细胞分裂即M期,染色质高度折叠凝聚;棒状结构(有些物种呈点状;此时基因表达已关闭;无RNA)可见,染色质和染色体不存在成分上的差异,只是包装程度和构型不同。它们是同一物质在细胞周期中不同阶段的运动形态。(二)化学组成通过分离的染色质生化分析与放射性同位素掺入的研究说明染色质的主要成份是DNA与组蛋白,同时还有非组蛋白和少量的RNA:1染色质DNA是生物遗传信息的载体,是染色质的主要成分。染色质和染色体是在细胞周期不同阶段可以互相转变的形态结构染色质与染色体具有基本相同的化学组成,但包装程度不同,构象不同。A.基因组大小比较基因组(genome):一个生物贮存在单倍染色体组中的总遗传信息物种进化程度越高,基因组越大凡是具有细胞形态的所有生物其遗传物质都是DNA。基因组大小通常随物种的复杂性而增加基因组中两类遗传信息:编码序列调控序列B.基因组DNA类型真核生物基因组的复杂性1、Genome:单倍体细胞中的全部基因(Onecopyofallthegeneticinformationofanorganism.)2、物种进化程度越高,基因组越大(Genomesizegenerallyincreaseswithanorganism’scomplexity.)Someamphibian两栖动物andplants植物havelargergenomesizethanhuman.Nosimplerelationshipbetweenchromosomenumber,speciescomplexity,andthetotalgenomesize.举例:毛冠鹿的雌体麂,这两个物种亲缘关系很近,毛冠鹿的染色体是23对,赤麂(2n=6♀;2n=7♂)贡山麂(2n=9♂)小麂(2n=46)罗氏麂(2n=7♂)黑麂(2n=8♀;2n=9♂);麂属动物的不同种间染色体数目差异很大,其变异幅度远远超过哺乳动物中其他的属;原因分析:在物种进化过程当中染色体发生融合,3.Proteincodingsequences(nonrepeated)2004年人类基因组测序完成后,发现Protein-codingregions:~1.5%;~25-50%oftheprotein-codinggenesareuniquesequence.4.TandemlyrepeatedgenesencoderRNAs,tRNAs,andHistones(Moderatelyrepeated)5SrRNAandpre-rRNAgenes:Morethan100copy/Genome.TandemlyrepeatedgenesencodeidenticalornearlyidenticalproteinsorfunctionalRNAs.Thesegenesareneededtomeetthegreatcellulardemandfortheirtranscripts.编码rRNAs,tRNAs,andHistones的基因是以大量短的重复序列存在,都是为了满足细胞在短时间对这些物质的大量需求(例如DNA复制需要大量组蛋白);ClassificationofeukaryoticDNATandem串联Centromericheterochromatin着丝粒异染色质
Retro-transposon反转录转座子,逆转录转座子,反转座子
真核细胞中每条染色单体只包装一条线性DNA分子,即一个DNA分子与染色体蛋白质等一起形成染色质纤维,经过多次螺旋卷曲,最后形成染色单体。一个DNA分子中有基因活性的区段只占10%左右。DNA分子一级结构具有多样性非重复序列DNA单一DNA(uniqueDNA)其顺序在基因组中只有一次或少数几个拷贝,多是结构基因顺序,能转录mRNA,是最终合成蛋白质的密码。中度重复DNA序列(middlerepetitiveDNA),部分中度重复序列具编码功能,可以编码rRNA,tRNA和组蛋白。重复次数在几十次——几千次(10—105),重复序列较长,这种DNA多数是不编码的,但有些区段能转录,多分布于次缢痕区。 短散在重复元件(shortinterspersedelements,SINEs),少于500bp 长散在重复元件(longinterspersedelements,LINEs),多于1000bp高度重复DNA序列(highlyrepetitiveDNA)重复次数在数百万次(105以上),如小鼠随体DNA可达107,重复序列短,这种DNA不能转录,多分布在着丝粒区、端粒区及异染色质区。 卫星DNA(satelliteDNA),主要分布在染色体着丝粒部位(105~107bp); 小卫星DNA(minisatelliteDNA),又称数量可变的的串联重复序列,常用于DNA指纹技术(DNAfinger-printing)作个体鉴定(102~105bp); 微卫星DNA(microsatelliteDNA)重复单位序列最短,具高度多态性,在遗传上高度保守,为重要的遗传标志(10~100bp)。(DNAfigerprintingandmicrosatellite;重复次数在人群中是不同的,PCR电泳,进行个体的识别,图谱标记)(Patemitytesting;亲子鉴定,可以多做几个座位;准确率可达99.99999%)DNA二级结构具有多形性(polymorphism)(2)三种构型的DNA(二级结构的多型性)生物界物种的多样性寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的不同排列之中。DNA一级结构具多样性;二级结构具有多型性。三种构型DNA: B型DNA(右手双螺旋DNA);活性最高的DNA构象; A型DNA,B型DNA的重要变构形式,仍有活性; Z型DNA,Z型DNA是左手螺旋,B型DNA的另一种变构形式,活性明显降低DNA构型的生物学意义沟(特别是大沟)的特征在遗传信息表达过程中起关键作用沟的宽窄及深浅影响调控蛋白对DNA信息的识别三种构型的DNA处于动态转变之中DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的,这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。2染色质蛋白质(负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。)(1)组蛋白(histone):与DNA非特异性结合。这种蛋白质种类不多,都含有较多的碱性氨基酸,如精、赖氨酸,依所含这两种氨基酸的比率不同将组蛋白分为五类。属碱性蛋白质,富含带正电荷的Arg和Lys等碱性氨基酸,可以和酸性DNA紧密结合,一般不要求特殊核苷酸序列核小体组蛋白-H2A,H2B,H3和H4-没有种属及组织特异性,进化上十分保守H1组蛋白-有一定的种属和组织特异性-构成核小体时H1起连接作用非组蛋白(nonhistone):指染色体上与特异DNA序列或组蛋白相结合的蛋白质,故又称序列特异性DNA结合蛋白。序列特异性DNA结合蛋白特性-多样性(不同组织细胞中)-识别DNA具有特异性(大沟;氢键,离子键;保守)-具有功能多样性(参与染色体的构建;启动基因的复制;调控基因的转录)非组蛋白是指细胞核中组蛋白以外的蛋白质。它不仅包括以DNA作为底物的酶,也包括作用于组蛋白的一些酶,如组蛋白甲基化酶。此外还包括DNA结合蛋白、组蛋白结合蛋白和调控蛋白,其中最丰富的一类是高速泳动族蛋白。非组蛋白的特性对DNA具有识别特异性,识别的信息来源于DNA核苷酸序列本身,识别位点存在于DNA双螺旋的大沟部分;识别与结合靠氢键和离子键,而非共价键;在不同的基因组文库之间发现这些序列特异性结合蛋白所识别的DNA序列在进化上是保守的。(凝胶延滞实验(gelretardationassay)检测的细胞抽提物+带有放射性标记的已知特异序列的DNA→凝胶电泳利用非组蛋白与特异DNA序列亲和的特点,通过凝胶延滞实验,可以在细胞抽提物中进行检测。)3序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式序列特异性DNA结合蛋白,在与DNA结合时,其结构域可有以下几种不同的模式。(1)α螺旋—转角—α螺旋模式(2)锌指模式(3)亮氨酸拉链模式(4)螺旋-环-螺旋结构模式(5)HMG框结构模式三染色质的基本结构单位——核小体人的46条染色体的长度大约2米,而人的细胞核的直径大约6微米,(如果将细胞核放大到网球大小,则人的染色体总长为20公里),因此要涉及到DNA包装的问题,其基本结构单位是核小体(一)实验证据-核小体的发现(未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝;透射电镜显示串珠状10nm的核小体结构)(间期细胞核通过一些试剂处理,是染色质在水面铺展,捞出来在电镜下观察,发现染色质直径是30nm;通过将组蛋白抽提掉,变成了10nm的串珠结构,珠子是核小体的核心结构,线就是双链DNA)那么核小体的具体成分是什么?(通过核酸酶的有限消化,将大鼠肝细胞中的染色质从中间打断,去除染色质蛋白质,将DNA片段进行电泳,结果显示梯度的带状图谱,片段大小正好是200bp左右的整倍数,提示,每一个核小体的DNA长度大约是是200bp)(Gelelectrophoresisafterremovalofchromatinproteins;Analyzedbyelectronmicroscopy;)(通过蔗糖梯度离心后,分离每部分,将三个峰值对应的成分收集,在电镜下观察,发现600bp,400bp,200bp分别对应有3,2,1个颗粒)X-raydiffractionX射线晶体衍射揭示核小体三维结构组蛋白八聚体外面一圈是由两个双螺旋DNA分子构成的(1.75圈);(应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术研究,发现核小体颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁园柱体,具有二分对称性(dyadsymmetry),核心组蛋白的构成是先形成(H3)2﹒(H4)2四聚体,然后再与两个H2A﹒H2B异二聚体结合形成八聚体(3Dofnucleosome;核小体核心颗粒中的一些组蛋白,黄的是H2A,红的是H2B,蓝的是H3,绿的是H4;,每一个组蛋白是两个分子,构成了组蛋白八聚体;外面一圈是由两个双螺旋DNA分子构成的(1.75圈);)(LugerK,MaderAW,RichmondRKetal.Crystalstructureofthenucleosomecoreparticleat2.8Aresolution.Nature,1997,389(6648):251-60.)总结:Thebasicrepeatunit,containinganaverageof200bpofDNAassociatedwithaproteinparticle,isthenucleosomeSV40微小染色体(minichromosome)分析:病毒DNA与宿主的组蛋白结合,形成串珠状微小染色体核小体的结构包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心颗粒,由4个异二聚体组成,包括两个H2A·H2B和两个H3·H4Histoneoctamer:(H2A-H2B)-(H3-H4)-(H3-H4)-(H2A-H2B)WhereisthehistoneH1?(H1位于进出核小体DNA核心颗粒进出部位;即DNA进出核心颗粒的部位)(因此H1组蛋白能够稳定核小体的结构)(稳定的力量来自两方面:a组蛋白核心颗粒含有碱性氨基酸,bH1组蛋白锁住DNA的进出口)(DNA带负电荷,因为DNA双螺旋的骨架是由磷酸残基和脱氧核糖组成,而碱基相连的磷酸基,能解离出氢离子,剩下的就是带负电的。H1moleculesareassociatedwiththelinkerregion.200bpDNA:146+15~50bplinkerDNA组蛋白:=1\*GB3①与DNA结合最丰富;ThemostabundantproteinsassociatedwitheukaryoticDNA=2\*GB3②带正电荷;Richinpositivelychargedbasicaminoacids,whichinteractwiththenegtivelychargedphosphategroupsinDNA=3\*GB3③保守性强;TheaminoacidsequencesofhistonesH2A,H2B,H3,H4areremarkablysimilaramongdistantlyspecies(与表观遗传学有很大关系,与染色质的结构和活性有很大关系)147bp+20bpLinkerDNA:60bp146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA,锁住核小体DNA的进出端,起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bpDNA的核小体结构又称染色质小体。两个相邻核小体之间以连接DNA相连,典型长度60bp,不同物种变化值为0~80bp。组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的,基本不依赖于核苷酸的特异序列核小体沿DNA的定位受不同因素的影响(DNA结合蛋白质;DNA的弯曲性)实验表明,核小体具有自组装(self-assemble)的性质核小体沿DNA的定位受不同因素的影响,进而通过核小体相位改变影响基因表达。核小体是不是在染色体上200bp一个一个地均匀分布的,有两个因素可以影响核小体的分布。⑴DNA结合蛋白质;在染色质上,除了组蛋白以外,还含有大量的非组蛋白(例如进行DNA复制和转录的酶,它们所在的位置会影响核小体在这个位置的形成);⑵DNA的弯曲性(DNAbending)(DNA小沟AT含量多,大沟GC含量多;缠绕时,小沟要变形,AT之间的氢键作用力要弱些,因此易变形;)1、用温和方法使核破碎,将染色质铺在钢网上在电镜下观察,间期染色质呈纤丝状结构,直径约在20—30nm,称染色质粗纤维。2、进一步用盐溶液处理,则显示10nm串珠状结构,称染色质细纤维,实际上是由核小体串连成的丝状结构—核小体丝。3、再用非特异性微球菌核酸酶消化10nm的染色质细纤维后进行电泳,则得到200个bp或其倍数的DNA片段。据此,Olins等提出了核小体结构模型。也曾称钮体(υ—body)和核粒。其结构要点包括:(1)每个核小体包括200bp左右的DNA和一个组蛋白八聚体分子及一分子组蛋白H1;(2)[H2A、H2B、H3、H4]2组成球形组蛋白的八聚体;【H2AH2B(H3)2?(H4)2H2AH2B】(3)166bp的DNA(核心DNA)以左手方向盘绕八聚体2圈,不含H1时,为146个bp的DNA缠绕1.75周。(组蛋白H1和166bpDNA的核小体结构称为染色质小体)(4)H1锁封DNA进出口,附在八聚体上(5)34bp(0~80)左右DNA连接两核心结构——连接区DNA(LinkerDNA)Olins&Kornberg认为:多个核小体连接而成10nm的形似念珠的染色质丝(核小体丝)是染色质的一级结构。染色质组装人体细胞46条染色体含DNA约6×109bp,总长如何计算?(一)染色质组装的前期过程裸露DNA组装直径30nm螺线管-H3·H4两个异二聚体结合-两个H2A·H2B异二聚体加入-组蛋白的去乙酰化,H1组蛋白结合伴随着核小体的折叠-6个核小体组成一个螺旋-进一步的折叠事件(二)染色质组装的多级螺旋模型一级结构:核小体二级结构:螺线管(solenoid)三级结构:超螺线管(supersolenoid)四级结构:染色单体(chromatid)7-6-40-5(直接2nm的双螺旋结构→11nm的串珠结构→30nm的螺线管→以loop环的形式结合在染色体骨架300nm→进一步螺旋700nm→最后形成染色体1400nm)1螺线管(体)(粗纤维)(二级结构,间期存在形式)2超螺线体(管)(超粗纤维)(三级结构,是染色质在有丝分裂前期的存在形式)美人Bak(1977)观察到,由30nm的螺线体再进一步螺旋化,便形成一条直径为400nm(0.4μm)的圆简状结构,即为超螺线体。3染色(单)体(Chromosome)(四级结构,是染色质在有丝分裂中期的存在形式)由超螺线体再经折迭螺旋,形成长2—10μm直径约2000nm(2μm)的染色单体,由于在间期已经复制,故这时观察到的染色体,应包括两条染色单体。染色质组装的放射环结构模型主要解释30nm的螺线管如何进一步包装成染色体的。由Leammli等报道,认为:30nm螺旋管折叠成环,沿染色体纵轴由中央向四周伸出,构成放射环。纵轴的中央为非组蛋白构成的染色体骨架,由30nm的螺线管折叠形成的DNA侧环(18个)从骨架向四周伸出形成“微带”,大约106个微带纵向排列构成子染色体。非组蛋白构成的染色体骨架(chromsomalscaffold)和由骨架伸出的无数的DNA侧环)30nm的染色线折叠成环,沿染色体纵轴,由中央向四周伸出,构成放射环。由螺线管形成DNA复制环,每18个复制环呈放射状平面排列,结合在核基质上形成微带(miniband)。微带是染色体高级结构的单位,大约106个微带沿纵轴构建成子染色体2.2nmDNA→11nmnucleosome→30nmfiber→Loop→Metaphasechromosome基因组结构和染色质组装一览图常染色质和异染色质常染色质(euchromatin)异染色质(heterochromatin)-结构异染色质(或组成型异染色质)(constitutiveheterochromatin)-兼性异染色质(facultativeheterochromatin)间期核中的染色质有两种状态常染色质(euchromatin):指间期核内染色质丝折叠压缩程序低,处于伸展状态(典型包装率750倍),
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