il-10基因启动子区单核苷酸多态性与高发区涉县人群食管鳞状细胞癌和贲门腺癌易感性的关系

il-10基因启动子区单核苷酸多态性与高发区涉县人群食管鳞状细胞癌和贲门腺癌易感性的关系

[tumor，2006，26（2）：157-162]。血管生成是恶性肿瘤发生和转移的一个基本过程。IL-10是一种重要的免疫抑制剂,由T淋巴细胞产生,可通过刺激血管生成因子基因表达来参与肿瘤血管生成,从而影响肿瘤的发生。IL-10基因位于染色体1q31-32,其启动子区-1082、-592等的多态性与IL-10表达有关。有报道表明,IL-10基因表达和食管鳞状细胞癌(ESCC)易感性呈正相关。但到目前为止,IL-10基因启动子区多态性与ESCC和贲门腺癌(GCA)易感性的关系尚未见报道。本研究通过病例对照方法研究了食管癌、贲门癌高发区涉县人群中IL-10基因启动子区多态性与ESCC和GCA易感性的关系。1材料和方法1.1病例选择及定义本研究包括经组织学证实的ESCC患者203例和GCA患者152例,同时以443例健康个体作为对照。ESCC患者和GCA患者是2001～2003年间在涉县经内镜普查并经当地医院经组织学检查确诊的门诊或住院患者,健康对照组来自2001～2003年同一地区经内镜普查证实无上消化道肿瘤及癌前病变的无关个体。肿瘤患者及健康对照个体的性别、年龄、吸烟习惯及家族史的情况均在采血后由专人询问获得。吸烟个体定义为过去或目前吸烟≥5支/d,持续至少2年以上者。将有1名一级亲属或2名以上二级亲属患食管癌/贲门癌/胃癌的个体定义为具有上消化道肿瘤(uppergastrointestinalcancers,UGIC)家族史。仅有部分病例及对照组个体获得了吸烟情况和家族史资料。1.2蛋白酶k-氯化钠盐析法抽取患者及对照个体的静脉血各5mL(采血前均未用过放、化疗),以枸橼酸钠抗凝,采用Miller等的蛋白酶K-氯化钠盐析法提取白细胞DNA。1.3pcr扩增dntps后,选择2e,3采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行IL-10G-1082A和C-592A基因型检测。扩增IL-10G-1082A和C-592A两位点的上游引物序列为5′-CACTACTAAGGCTTCCTTGGGA-3′,下游引物序列分别为5′-GTGAGCAAACTGAGGCACAGACAT-3′和5′-CCTAGGTCACAGTGACGTGG-3′,扩增片段分别为310bp和748bp。PCR反应体系为20μL,其中模板DNA100ng,10×PCRbuffer2.0μL,MgCl21.5mmol/L,Taq-DNA聚合酶2U,dNTPs200μmol/L和上、下游引物各200nmol/L。阴性对照用蒸馏水代替模板DNA。IL-10G-1082A位点反应条件为:94℃5min预变性后,94℃变性30s,60℃退火50s,72℃延伸40s,35个循环后,72℃继续延伸7min。用10UEcoNⅠ对PCR产物进行37℃酶切过夜。酶切产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并用0.25%的硝酸银染色。A/A基因型为252bp、39bp和19bp,G/G基因型为271bp和39bp,A/G基因型为271bp、252bp、39bp和19bp(图1)。IL-10C-592A位点反应条件为:94℃5min预变性后,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环后,72℃继续延伸5min。用10URsaⅠ对PCR产物进行37℃酶切过夜。电泳及染色同上。酶切后产生240bp、236bp、222bp、42bp和8bp5个条带的为A/A型,产生476bp、222bp、42bp和8bp4个条带的为C/C型,产生476bp、240bp、236bp、222bp、42bp和8bp6个条带为A/C型(其中42bp和8bp已出胶,240bp和236bp由于相对分子质量接近,在凝胶中显示为一条带)(图2)。1.4非条件logistic回归分析病例及对照组的SNP基因型及等位基因型分布比较采用χ2检验。应用非条件logistic回归模型统计经性别、年龄调整后的OR值和95%可信区间。统计分析应用SPSS10.0软件包。采用EH软件计算病例及对照组IL-10的单体型频率。2结果2.1-年龄和性别校正的or值ESCC、GCA患者组的性别、年龄分布与健康对照组相比无显著性差异(P>0.05)。在健康对照组、ESCC患者组、GCA患者组中,吸烟者所占比例分别为33.2%、55.5%和66.7%,统计学分析显示,吸烟能显著增加ESCC和GCA的患病风险(经年龄和性别校正的OR值分别为1.88和2.89,95%CI分别为1.29～2.74和1.86～4.48);ESCC、GCA患者组UGIC家族史的阳性率分别为52.2%和61.2%,明显高于健康对照组(37.0%),因此,UGIC家族史也能显著增加ESCC和GCA的发病风险(经年龄和性别校正的OR值分别为1.84和2.92,95%CI分别为1.28～2.66和1.89～4.53)(表1)。P-valueforttest;b:Informationonsmokingstatuswasavailablefromsomeofsubjects,smokingsignificantlyincreasedtherisktodevelopESCCandGCA.AgeandsexadjustedOR=1.88(95%CI:1.29-2.74)and2.89(95%CI:1.86-4.48);c:InformationonfamilyhistoryofUGICwasavailablefromsomeofsubjects,positivefamilyhistoryofUGICsignificantlyincreasedtherisktodevelopESCCandGCA,too.AgeandsexadjustedOR=1.84(95%CI:1.28-2.66)and2.92(95%CI:1.89-4.53)2.2基因型频率分布健康对照组IL-10-10823种基因型(A/A、A/G、G/G)频率分别为60.3%、37.0%、2.7%,A和G等位基因频率分别为78.8%、21.2%;ESCC患者组3种基因型频率分别为57.6%、39.9%、2.5%,A和G等位基因频率分别为77.6%、22.4%,其基因型与等位基因型分布与健康对照组相比均无显著差异;GCA患者组3种基因型频率分别为61.2%、36.8%、2.0%,A和G等位基因频率分别为79.6%、20.4%,其基因型与等位基因型分布与健康对照组相比也无显著差异(表1)。以A/A基因型作参照,A/G和G/G基因型相加以及G/G基因型单独与其相比,不能增加ESCC发病风险(经年龄、性别校正OR值分别为0.95和1.09,95%CI分别为0.58～1.89和0.90～1.32),亦不能增加GCA发病风险(校正OR值分别为1.22和1.05,95%CI分别为0.44～2.01和0.69～1.64)(表2)。IL-10-5923种基因型(A/A、A/C、C/C)频率在ESCC患者组中为46.8%、43.3%、9.9%,在GCA患者组中为42.1%、48.7%、9.2%,分别与健康对照组(41.1%、44.2%、14.7%)相比均无显著性差异;ESCC患者组中A和C等位基因频率为68.5%、31.5%,GCA患者组为66.4%、33.6%,分别与健康对照组(63.2%、36.8%)相比亦无显著性差异(表1)。以A/A基因型作参照,A/G和G/G基因型相加以及G/G基因型单独与其相比,均未增加ESCC及GCA的发病风险(表2)。2.3il-10-1082a/g和g/g基因型推行对gca发病风险的影响为比较个体吸烟状况对ESCC及GCA易感性与IL-10多态性关系的影响,本研究根据ESCC及GCA患者有无吸烟史进行了分层分析,与A/A基因型相比,吸烟患者与非吸烟患者IL-10-1082A/G和G/G基因型相加均未增加ESCC及GCA的发病风险,且在IL-10-592中也无统计学意义。而根据UGIC家族史进行的分层分析表明,UGIC家族史阳性患者与UGIC家族史阴性患者IL-10-1082A/G和G/G基因型相加均未增加ESCC及GCA的发病风险,IL-10-592A/C和C/C基因型相加也未增加ESCC及GCA的发病风险(表3)。2.4组il-10的4个月的体型采用EH软件对IL-10-1082和-592两位点SNP进行单体型分析,结果显示,健康对照组IL-10的-1082A/-592A单体型最常见(54.4%),其次为-1082A/-592C(24.4%)、-1082G/-592C(12.4%)及-1082G/-592A(8.8%),ESCC、GCA组的单体型频率与对照组相比均无显著差异(表4)。3il-10与正常患者的关系中国是食管癌的高发国家,而河北省涉县则是食管癌的高发区之一。近年来,随着病理诊断水平的提高,发现既往登记的食管癌中混杂着大量的贲门癌患者。贲门在人体内食管与胃的交界处,贲门癌的流行病学、发病机制和临床特征均与胃体肿瘤不同,而与食管癌相似,提示贲门癌可能与食管癌有共同的致病因素。病理学诊断发现,食管癌发生于食管黏膜上皮的基底细胞,绝大多数是鳞状上皮癌,腺癌起源于食管者甚为少见,多位于食管末端。贲门癌多为腺癌,也可延伸侵入食管。对此本课题组分别研究了IL-10启动子区多态性与ESCC、GCA发病风险的关系。包括营养缺乏、不健康生活方式(吸烟、饮酒等)、致病菌感染等在内的外源因素一般被认为是这2种癌症发生的危险因素。然而,并非所有暴露于以上危险因素的个体都会发展为ESCC和GCA,这表明个体易感性在癌症发展中可能起重要作用。本课题组进行了一系列关于ESCC和GCA的个体易感性的研究,例如:亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、醌氧化还原酶(NQO1)、胸苷酸合成酶(TS)等,其基因的多态性均与ESCC及GCA的患病风险有关。因此,这些基因多态性单独或与环境因素作用可能是ESCC和GCA高患病风险的检测指标。在肿瘤高发区存在着上消化道肿瘤的家族聚集性,以往研究发现,UGIC家族史显著增加了人群患ESCC和GCA的风险。本研究发现,吸烟史和UGIC家族史显著增加患ESCC和GCA的危险性。IL-10在抗原呈递方面具有抑制作用,因此被作为一种免疫抑制剂。最近研究表明,人类肿瘤细胞可产生IL-10,它具有抑制抗肿瘤免疫发生的特性,与多种恶性肿瘤的转移和预后有关。它一方面促进肿瘤细胞的旺盛生长,另一方面进入血液循环对机体的免疫系统产生不同程度的抑制作用。高IL-10水平具有肿瘤促进作用,在各种肿瘤患者中可检测到血清IL-10高表达。在食管癌患者中,IL-10的表达率高达93%。Wojciechowska-Lacka等的研究认为,IL-10表达是肺癌的一个预后指标。他们发现,治疗前所有患者的血清IL-10水平升高,但对治疗敏感的患者治疗后血清IL-10水平下降至正常范围。实验证实,-1082G等位基因和-592C等位基因可使血清IL-10表达增高,携带IL-10-1082G/-592C(