葡萄基因组DNA提取方法的比较

葡萄基因组DNA提取方法的比较园艺专业指导教师摘要：以葡萄嫩叶为材料提取基因组DNA，为了减少酚类及色素等物质的影响，采用经过改良的SDS法和CTAB法对葡萄叶片进行基因组DNA提取，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带，用紫外分光光度计测定其在波长260nm和280nm处的吸光值，并根据OD/OD的比值分260280析其DNA的纯度。试验结果表明，关键词：葡萄；DNA提取；CTAB法；SDS法TheComparisonofGrapesGenomicDNAExtraction

MethodStudentmajoringinhorticultureTutorAbstract：Inordertoreducetheinfluenceofphenolicandpigmentandothermaterial,extractDNAfromgrapeleavesformaterial.ExtractgenomicDNAofgrapeswiththemodifiedSDSmethodandCTABmethod,examinetheDNAbandswithagarosegelelectrophoresis,determinetheabsorbancebetweenthewavelengthin260and280nmwithUVspectrophotometer,andanalysisthepurityofDNAaccordingtotheratiooftheOD260/OD280.Keywords:Grapes;ExtractedDNA；CTABMethod;SDSMethod引言生物遗传信息的载体，是分子生物学的基础。DNA主要集中在细胞核内，线粒体、叶绿体中也含有不少的DNA，在细胞中它以与蛋白质结合的状态存在。1953年Watson和Crick两人提出了DNA分子的双螺旋结构模型，它的提出拉开了分子生物学的序幕，为分子遗传学的发展奠定了基础。维持DNA双螺旋结构稳定的力主要有三种：一种是互补碱基之间的氢键，它在使四种碱基形成特异性的配对上是十分重要的，但并不是维持DNA结构稳定最主要的力，而且氢键的断裂具有协同效应；第二种力是碱基堆积力，是维持DNA稳定的主要力量；第三种力是DNA骨架磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键。DNA在生理pH条件下带有大量的负电荷，要是没有阳离子（或带正电的多聚胺、组蛋白等）与它形成离子键，DNA链由于自身不同部位之间排斥力的作用也是不稳定的。原核细胞的DNA常与精胺、亚精胺结合，真核生物细胞的DNA则在核内与组蛋白结合。多糖污染是木本植物DNA提取中最常遇到的问题。多糖污染的DNA呈粘稠的胶状，不但给实验操作带来不便，更重要的是多糖对反应体系中的酶活性产生抑制作用，严重影响分子生物学研究的下游工作“。很多多年生木本果树，即使其幼嫩组织多糖的含量也明显高于大田作物［2］。植物基因组DNA质量检测对所提取的DNA浓度、纯度、构型、相对分子质量的大小等基本情况进行检测分析。有时DNA中含有酚类和多糖类物质会直接影响酶切和PCR的效果。利用DNA分子和蛋白质分子分别在紫外光区波长260nm和280nm处存在最大吸收峰的特性进行分光光度分析，测定DNA样品的纯度。根据A260/A28°比值可以估计DNA样品的纯度，纯DNA样品的A26Q/A280比值为1.8,纯RNA样品的比值为2.0，若DNA样品的A26°/A280比值大于1.8，说明样品中存在RNA；反之比值小于1.8,说明样品中蛋白质杂质未除尽⑶。琼脂糖凝胶电泳是检测DNA完整性和分离不同分子量DNA的一种方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取出来的。由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的点用介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。琼脂糖的特点是不含核酸酶，电泳速度快，经EB染色后，荧光背景非常低。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片断的范围为0.2〜50kb之间；若分辨较小相对分子质量的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1bp〜1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就越大，其分辨能力也就随之减弱。植物基因组DNA提取方法虽然很多，但每种方法最关键的有3步。第一，破碎细胞壁和细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中；第二，消除蛋白质、多糖、色素等杂质的污染；第三，防止DNA的降解。各种方法都是针对以上3步做了不同的改进和完善。一般而言，一个优良的DNA提取方法应符合以下标准：①所得到的DNA应当完整，电泳检测时应得到精确性高、重复性好的迁移带型；②所得的DNA纯度应满足后续操作的要求；③所得的DNA应有足够的量；④操作程序应当快速、简便、成本低，并尽可能避免使用有毒试剂。1材料和方法试验材料试验材料取自葡萄扦插苗。供试葡萄品种为户太八号，是西安市葡萄研究所从欧美杂交品种奥林匹亚芽变中选育的鲜食兼加工的品种。根系发达，生长和萌芽力强，成花能力强，取样时间为2011年4月25日。材料首先用蒸馏水清洗除去表面污物，用纱布或滤纸吸干表面残留水分，去掉叶柄，备用。试验方法1.2.1CTAB法（1）试剂DNA缓冲液：2%CTAB（m/v）本实验采用30g/L70%乙醇，无水乙醇，ddH2O（灭菌）0.1mol/LTris-HClpH8.0,25mmol/LEDTApH8.0（母液0.5mol/L，乙酸钾5mol/LpH8.0）1.4mol/LNaCl，2%0-巯基乙醇200mL:另外加入了抗氧化剂：1%抗坏血酸，2％PVP，2％Na2S2O5[4]。0.1mol/LTris-HCl：在800mL水中溶解12.11gTris碱，加入浓HC1调节pH值至8.0。2）方法2.0mL离心管加入500yLCTAB提取液（已加入卩-巯基乙醇和PVP）在65°C水浴中预热。在液氮中研磨l.Og新鲜或者一20C冷冻的样品材料，将粉末迅速转移到上述离心管中，65C水浴30min。期间每隔lOmin轻轻摇动离心管。加入5mol/L的乙酸钾充分混匀，在水浴中放置30min，4Cl2000rpm离心5min,吸取上清液。剪掉尖的吸头（防止吸到沉淀）吸取上清液到1.5mL新离心管中，用氯仿：异戊醇（24:1）重复抽提一次。12000rpm常温离心lOmin。用剪掉尖的吸头（防止吸到沉淀）吸取上清液到1.5mL新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇,轻柔的颠倒混匀，一20C静置30min,沉淀DNA。12000rpm常温离心10min,弃上清液，得到DNA沉淀。用500yL冰冷的70%乙醇洗涤沉淀2-3次，每次都是8000rpm常温离心4min,弃上清，注意防止DNA丢失。用500吐无水乙醇洗涤沉淀，吹干后用200吐TE溶解DNA。溶解后的DNA再用氯仿：异戊醇（24:1）抽提一遍。12000rpm常温离心10min。用剪掉尖的吸头吸取上清液到1.5mL离心管中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻柔的颠倒混匀，一20C静置30min,沉淀DNA。8000rpm常温离心，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，再用无水乙醇洗沉淀,吹干后，用50吐TE（含有RNAase50yL/mL）溶解DNA。37C保温60min【5-8。1.2.2改良SDS法干燥叶片，用去离子水洗净，在液氮中研磨10min,分装3管。加人800吐的SDS提取液（临用前加入2吐卩-巯基乙醇，20%的PVP100吐），轻轻振动，65C条件下水浴30min；加入90吐15mol/L的KAc。一20°C条件下冰浴30min；4°C、10000rpm离心15min；取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）,轻轻振动；4C,10000rpm离心15min；取上清液，加入等体积异丙醇，轻轻振动几下，室温静置30min,12000rpm离心10min,取沉淀加入预冷的75%乙醇洗涤干燥；沉淀用500yLTE溶解，静置5min,加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)。轻轻振动几下，静置10min；4°C12OOOrpm离心10min：取上清液，加入lyLRNAase轻轻振动，混匀，37C条件下保温1h,加入600yL氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻振动；4C，12OOOrpm离心10min；取上清液，加入2.5mol/L的醋酸铵60yL，加入2倍体积的无水乙醇，室温静置30min，12000rpm离心10min；去除上清，沉淀干燥后，用30mLTE在37C水浴溶解DNA,RNAase消化RNA[9]。DNA质量检测1.3.1琼脂糖凝胶电泳检测制作1%的琼脂糖凝胶：称取0.15g琼脂糖，用500倍的TAE18m1微波炉加热溶解，滴入2ulEB，做成胶，放置30min。吸取提取的DNA溶液5吐，电泳检测。用九DNA做分子量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker20kb的带相应位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA完整，没有降解。1.3.2提取的DNA的浓度检测取少量待测DNA样品，用TE或者蒸馏水稀释50倍。用TE或者蒸馏水做空白，在260nm、280nm、310nm处调节紫外分光光度计的读数至零。加入待测DNA样品在三个波长处读取OD值。纯DNA样品的0。260/0。280大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染DNA浓度计算双链DNA(dsDNA)：[dsDNA]=50x(OD260-OD310)x稀释倍数RAPD-PCR扩增试验采用10》1反应体系，其中含10mmo1/LTris-HCl(pH=8.3)，50mmo1/LKC1，2.5mmo1/LMgC12，0.01mg/m1明胶，0.2mmo1/LdNTPs，5pg牛血清蛋白，1.5UTaqDNA聚合酶，2~5ng模板DNA，0.2》mol/L引物P](5'TGCCGCCAAG3')。扩增程序：94C预变性4min；94C变性30s,30〜40C退火40s,72C延伸1min，40个循环；72C延伸10min；4°C保存。扩增反应结束后，每管取5》1扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，约1h。电泳结束后，采用凝胶成像系统拍照。2结果与分析2.1DNA电泳检测分析葡萄基因组DNA提取液电泳结果如图1所示，1〜3为改良SDS法提取的DNA,4〜6为CTAB法提取的DNA，根据条带亮度和RNA消化情况，可以看出SDS法和CTAB法均有拖尾现象发生；在点样量相等的条件下，CTAB法提取的DNA中RNA消化不完全，但是从亮度看，所提取的DNA峰值较高。从而说明CTAB法较改良SDS法提取的葡萄基因组DNA产率较高。在实验中，可以通过调节体系中RNase终浓度消除RNA对本底的影响，图1。I注：I注：M为分匚2.2比色参数测e法提取DNA由表1可知不同方法所提取的DNA在纯度及浓度有所差异。根据260nm、280nm、310nm的吸光值，按公式计算各处理OD260/OD280和DNA产量，试验260280结果如表1所示。改良SDS法提取葡萄基因组DNAOD260/0D简1.7〜1.8之间,260280说明样品中存在较多蛋白，应该进一步抽提或者调解氯仿和异戊醇比例，以消除蛋白质的影响。CTAB法提取的DNA白色絮状沉淀，溶解后溶液清亮，无粘稠感，浓度也较高，OD260/OD280在1.9〜2.0之间，说明该方法提取的DNA样品中基本无多糖和酚类等杂质的污染，纯度较好，但是RNA未消化彻底，在实验中需要增加RNase。比较两种提取方法对葡萄基因组DNA产量的影响，改良SDS法提取DNA平均产量为1362.5ng/pl，CTAB法为1596.67ng/pl。表1不同葡萄基因组DNA提取结果比较Table1ComparisonoftheresultofdifferentgrapegenomicDNAextraction处理叫60叫80叫10OD260/OD280产量ng/“l改良10.5980.3390.0561.7641355SDS20.6240.3550.0481.758144030.5560.3120.0391.782129240.6360.3340.0621.9041435CTAB50.6850.3480.0671.968154560.7930.3970.0691.9971810图2不同方法提取模板DNA对RAPD反应的影响Fig.2EffectsoftemplateDNAofdifferentgrapegenomicDNAextractiononRAPDreaction注：1〜3改良SDS法；4〜6为CTAB法RAPD-PCR扩增通过RAPD-PCR扩增试验，改良SDS法和CTAB法提取葡萄基因组DNA完全可以作为模板，随即扩增均具有特征条带（图2）。电泳结果表明，两种方法条带亮度不同。1〜3为改良SDS法提取DNA作为模板，4~6为CTAB法提取DNA为模板，前者扩增条带暗淡，说明RAPD-PCR扩增结果受模板DNA浓度影响较大。对于RAPD反应，稳定可重复试验结果受体系中Mg2+农度、TaqDNA聚合酶活力、dNTPS浓度和退火温度的影响。除此之外，模板DNA浓度和纯度也是一个不可忽视的重要因素。如样品中蛋白质、多糖及酚类物质较多，扩增条带就比较微弱，本试验充分说明了这一点。本试验结果表明两种方法提取的葡萄基因组DNA可满足RAPD-PCR扩增要求，但仍需要进一步优化［⑹。3讨论目前，关于植物总DNA的提取方法已报道了许多，各种方法均有其优缺点。CTAB是种去荷剂，它既可以裂解细胞，又可与DNA形成复合物而溶于高盐溶液中，当盐浓度降低时此复合物将析出，同时CTAB法有效地沉淀多糖。对酚类化合物的去除效果不是很理想，实验步骤也比较繁琐。实际应用中可根据具体的要求选择适当的提取方法［11］。SDS也是去污剂，可直接裂解细胞，使其释放出棱DNA，经过一些步骤的改进，结果显示DNA的质量很好。但是，其产量很低，且不能有效去除蛋白质污染，DNA降解严重。而CTAB法产物的蛋白质杂质较少，DNA降解程度轻，且产率较高。充分满足了分子检测的要求。CTAB能与核酸形成特异的可溶性复合物，对DNA的选择溶解性强。在抽提过程中加入CTAB，可使蛋白质等大分子物质的萃取更为彻底，原因可能是因为加入CTAB，调节至高离子强度的溶液时，酚和氯仿连续抽提后可去除CTAB、黏多糖和蛋白质复合物等杂质，使提取的DNA纯度提高［12,13］。两种方法所提取的葡萄基因组DNA均可用于PCR操作•所得RAPD条带清晰，重复性好。其中改良SDS法的DNA浓度较低，但扩增后产物浓度却很高，说明所得DNA的质量较高，相反CTAB的质量就较低。总之，扩增后的分析结果与上述结果基本保持一致。总之，CTAB法效果较好，当然实际应用中可根据具体的要求选择适当的提取方法。为了更有效地去除杂质，提高DNA的质量，采取了以下措施：①在适当步骤中加大了离心力和离心时间；②所有方法中均避免了酚的使用，采用氯仿一异戊醇抽提，克服酚对人体的危害及酚的残留对下一步分子操作带来的困难；③PVP（聚乙烯吡咯烷酮）酚类结合试剂，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易除去。2种方法中均加入了一定量的PVP，其中改良SDS法是在研磨过程中添加适量PVP，0-巯基乙醇具有阻止酚类物质氧化的作用，可有效地防止褐变，二者的联合使用在去除葡萄酚类化合物方面取得了良好效果。致谢首先感谢的是我的导师刘更森老师，论文工作是在刘老师的悉心知道下完成的，从论文的选题到最终完成，刘老师都倾注了大量的时间和精力，及时指导我解决所遇到的难题。毕业在即，谨向尊敬的刘老师致以最真挚的感谢和最久远的祝福。此外，我还要感谢的是与学院的所有老师们，是他们给我提供了严谨的科研环境。在此，衷心地祝愿他们工作顺利，身体健康。最后感谢在这四年中所有给过我帮助和支持过我的人，衷心感谢他们为我所作的一切。参考文献：程运江，伊华林，庞晓明,郭文武，邓秀新.华中农业大学学报，2001,20(5):481〜483李春霞，李宏飞.CTAB法高效提取苹果叶片DNA的研究•北方园艺,2009,(