植物表达载体转化农杆菌

3.2.2.4植物表达载体转化农杆菌1)农杆菌感受态细胞的制备a.从-70℃保存的农杆菌菌株EHA105甘油管中蘸取农杆菌菌液，在无抗的YEP固体培养基上活化两次。b.挑取单菌落接种于20mL无抗的YEP培养液中，28℃，200r/min遮光过夜振荡培养。c.按2~4%的接种量转接于无抗的50mLYEP培养液中，28℃，200r/min，振荡培养5~6h，至OD600为0.5左右。d.分装菌液于50mL离心管中，冰浴30min.e.4℃，4,000r/min离心10min，收集菌体f.用5mL预冷的20mmol/LCaCl2重悬菌体g.4℃，4,000r/min离心10min，弃上清。用预冷的和80%的甘油混合物（4：1）重悬菌体。。2mL20mmol/LCaCl2。h.在冰浴盒中按每管100~120μL的量分装于1.5mL离心管中。i.用液氮快速冷冻，存放于-70℃冰箱。2)冻融化转化农杆菌分别取2μL表达载体质粒加入到装有农杆菌感受态细胞的离心管，冰浴30min，37℃水浴3~5min，再冰浴5min，加入800ul无抗YEP培养液，28℃振荡培养4~5h。4℃，5,000r/min离心5min后，倒掉部分上清至剩余菌液约200μL，涂布于含有Kan和Rif的抗性YEP培养基上，28℃暗培养2d左右至单菌落出现。3)转化子的PCR检测以冻融化转化平板上长出的单菌落为模板，用基因特异引物进行PCR菌液检测。3.2.2.5农杆菌介导的PHD1基因对玉米愈伤组织的遗传转化3.2.2.5.1玉米幼胚愈伤组织的诱导选取人工授粉后11~14d、幼胚大小在1.5~2.0mm的果穗，去苞叶直至最后一层，75%的酒精表面消毒，在超净工作台上，用手术刀削去籽粒部分胚乳，用7d左右及时去芽去根以确保愈伤组织的正常生长。在诱导培养基上，26±1℃暗培养30d左右。镊子挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基上，3.2.2.5.2愈伤组织继代培养将愈伤组织转移到继代培养基上，25℃暗培养。每20d左右继代一次，每选外观呈现淡黄色、结构紧密的愈伤组织。继代3~4次的胚织便可用于基次继代都挑性愈伤组因遗传转化。3.2.2.5.3农杆菌侵染液的制备从-80℃冰箱中取出保到YEP平板（含50mg/LKan和50mg/LRif）上，48h左右直至长出单菌落。挑取单菌落，接种到2mL含50mg/LKan和50mg/LRif的YEP液体培养基28℃、200r/min避光振荡培养12h。将活化后的工程菌液按1:50～1:100的比存的含目的基因载体的工程菌菌种，接种28℃暗培养中，例加入到50mLYEP液体培养基中（含50mg/LKan和50mg/LRif），28℃、200r/min避光振荡进行扩大培养。在分光光度计上测定菌液的OD600值，待工程菌长至对数生长r/min离心5min收集菌体，养基重悬，备用。期（OD600=0.5～0.6），将菌液转入50mL无菌离心管中，4℃、3,000再将菌体用等体积的添加100μmol/LAS的浸染培3.2.2.5.3农杆菌侵染玉米胚性愈伤组织将继代培养7d左右，2~5mm大小的胚性愈伤组织转移到无菌的培养瓶中，加入适量制备好的农杆菌工程菌液，浸泡10min，此间要不时地摇动。浸泡完后，弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。将浸染过的愈伤组织接种于共培养培养基22℃暗培养3d（以肉眼可见菌落为准）。上，3.2.2.5.4胚性愈伤组织的恢复培养将共培养后的愈伤组织置于无菌的培养瓶中，先用无菌水清洗3~5次，直到无菌水澄清不见菌丝为止。再用400mg/L的头孢霉素浸泡洗涤30min，最后再用无菌水漂洗2遍，彻底洗掉附着于愈伤组织表面的无菌滤纸吸干多余水分，至恢复培养基上，26℃暗培养1周左右。农杆菌。将愈伤转接3.2.2.5.5胚性愈伤组织的筛选培养将经过恢复培养的愈伤组织接种到除草剂筛选培养基上，26℃暗筛选三轮。三轮除草剂浓度依次为1、2、3mg/L[132]，每轮筛选培养20d。每次将明显褐化、死亡的愈伤组织淘汰，而将生长良好、颜色淡黄、质地酥松的胚性愈伤组织，以及在褐化愈伤组织上新长出的胚性愈伤组织继续筛选培养。筛选结束后，挑选抗性愈伤组织转接到恢复培养基上，26℃暗培养15d左右，使抗性愈伤繁殖增生以利于后期的分化再生。3.2.2.5.6抗性愈伤组织的分化及植株再生经过恢复培养的抗性愈伤组织转接到除草剂浓度为1mg/L的分化培养基上，28℃，2000lx，12h/d光照培养小苗长到1.5~2cm时，将5cm左右，长出几条新根，抽出2~3片新叶后，防止霉菌污染，炼苗2~3d。幼苗适应洗根净部的培养基，剪掉老根和枯叶，移栽以1/2的MS培养基浇灌，待幼苗健壮后移栽至大田。。待分化出的其转到生根壮苗培养基上。小苗长到打开瓶盖，加少量无菌水覆盖培养基表面，室内环境后，将其从培养瓶中取出，到高温灭菌的营养土中，3.2.2.6农杆菌介导的PHD1基因对玉米茎尖的遗传转化3.2.2.6.1玉米转化受体的建立挑选无虫无病的优质玉米种子，用70%乙醇灭菌8min，0.1%升汞灭菌7-10min，无菌水洗涤3次（第1次2倍种子体积无菌水洗1min，第2次3倍洗2~3min，第3次2倍洗1min），灭菌期间不断摇晃种子，以保证表面灭菌彻底。然后加1.5倍种子体积无菌水，封口后放在黑暗条件下24~26℃浸泡5~6h。再用0.1%升汞灭菌8min，无菌水洗涤5次（第1次1倍种子体积无菌水洗1min，第2次2倍种子体积无菌水洗1min，第3次2~3倍种子体积无菌水洗2~3min，第4次1~2倍种子体积无菌水洗5min，第5次0.5倍种子体积无菌水洗1min），然后放入萌发盒，在黑暗条件（26~28℃）下萌发。2~3d后将萌发盒中长势一致的幼芽转至改良MS培养基中于黑暗条件（26~28℃）下继续培养3~5cm时，用解剖刀将幼苗的根切至1cm左右，剥去胚芽鞘及2~3片幼叶，出芽尖生长点，再用解剖刀从中部纵向切伤茎尖生长点。切伤茎间生长点的无菌。待胚芽长至露苗用于农杆菌转化。3.2.2.6.2农杆菌活化和玉米无菌苗转化将带有目的基因载体的工程菌在附加抗生素的YEP培养基中4℃、3000r/min离心5min，收集菌体添加100μmo/LAS的浸染培养基重悬。然后将菌液倒在灭菌的枪盒内部，然后将孔（该枪盒孔的直径为0.5cm左右，大于28℃,200r/min下振荡培养，使细菌处于对数生长期。在，将菌体用等体积的切好的材料一颗颗倒插入枪盒内部的材料直径，材料既能顺利插入又能保证种子不掉下去，）使已被切伤的无菌苗茎端浸泡在菌液中，抽真空（0.05MPa）感染10min。栽至原来的培养基上，23℃暗培养幼苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中，并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部，在人工气候室避光生长浸染后的茎间用无菌滤纸吸干，将幼苗2~3d。之后取出幼苗，用温水将培养基清洗干净，然后将2~3d。然后让植株在光照下生长，日温22~28℃，夜温15~21℃。隔天浇灌1/2MS培养基的无机盐溶液。3.2.2.6.3转化植株的筛选与定植待幼苗长至两叶一心时，将其移至人工气候室外面气温稍低的地方均匀喷施合适浓度的除草剂Basta水溶液进行筛选。喷施以植株叶片不掉液滴为宜。放置1h左右，待除草剂稍干之后移回人工气候室。喷施除草剂15d左右可将幼苗移栽至大田。3.2.2.7转基因植株的分子检测3.2.2.7.1T0代转基因植株PCR检测取抗性植株和未转化植株叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，用紫外分光光度计检测玉米基因组OD260/OD280值，保留符合要求的DNA以备后续试验，不符合要求的重新提取。以质粒PCUB-ubi-Z(O)DNA-bar为阳性对照，未转化植株叶片基因组DNA为阴性对照，根据PHD1基因序列与启动子序列结合设计跨越启动子和目的基因的特异引物进行PCR检测。上游：5’-CGTTCGGATGATTACCCTG-3’下游：5’-TGCTCACCCTGTTGTTTGG-3’。3.2.2.7.2T1代转基因株系的筛选和PCR检测将来自PCR阳性的T0代植株种子播种，幼苗期用Basta水溶液均匀喷洒植株，检测T1代个体的除草剂抗性。除草剂喷施3d后，未转化对照和部分T1代株系的叶尖开始发黄，一周后叶片逐渐枯黄，15d后整株死亡；部分T1代株系的叶片保持绿色或叶片发黄程度较轻（图21），表现出明显的除草剂抗性，在除草剂喷施后的半个月内有1~2片新叶长出。取存活植株的新叶进行PCR检测。3.2.2.7.3T1代转基因株系的定量PCR检测为检测PHD1基因过量表达的效果，提取T1代株系与未转化叶片的RNA。（方法参照。。。）凝胶电泳检测其完整性。紫外分光光度计检测RNAOD260/OD280检测其纯度。如果符合要求可进行下一步实验。模板CDNA(方法参照。。。。。。)3.2.2.7.4Real-timeRCR表达验证实验扩增反应在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，标准样品和待测样品均设4次重复，反应体系及程序如下：成分用量cDNATemplate2µLPCRForwardPrimerPCRReversePrimer0.5µL0.5µLSYBR®RremixEx10µLTaqTM(2×)ROXⅡ0.4µL7µL20ulRNAFreeddH2OTOTALPCR反应程序5:95℃30s95℃60℃72℃95℃5s34s30s1min40cycles1cycle65℃60℃到95℃绘制熔解曲线3.2.2.7.5SouthernBlot1min1cycle71cycles试剂配方：1)CTAB提取液（400ml）：CTAB，8g；1MTris-HCl，40ml；0.5MEDTA，6ml；NaCl，32.72g；亚硫酸氢钠，2g；10﹪PVP，40ml；巯基乙醇，4ml。2)20×SSC（1L）：NaCl：175.3g柠檬酸三钠（294.1g/mol）：88.2g，PH=7（1MHCl微调）去离子水定容至1L，高温高压灭菌，室温储存3)脱嘌呤缓冲液（0.25mol/LHCl）：21.5ml浓HCl加灭菌后的去离子水至1L，无需灭菌，室温储存。4)变性缓冲液（1L）：NaCl（1.5mol/L），87.66g；NaOH（0.5mol/L），20g去离子水定容至1L，高温高压灭菌，室温储存。5)中和缓冲液（1L）NaCl（1.5mol/L）：87.66g；Tris（0.5mol/L）：60.5g；PH=7.2（浓盐酸调，约10ml）去离子水定容至1L，高温高压灭菌，室温储存6)、10％（W/V）SDS:(100ml)称10gSDS，68℃加热溶解PH=7.2（浓盐酸调）灭菌去离子水定容至100ml，无需灭菌，室温储存7)Washingbuffer（1L）：Maleicacid（0.1M），11.6g；NaCl（0.15M），8.76g；Tween20（0.3％（V/V）），3ml；PH=7.5（NaOH约4.3g，初始PH约1.78）高温高压灭菌，室温储存8)Maleicacidbuffer（500ml）：Maleicacid（0.1M），5.8g；NaCl（0.15M），4.38gPH=7.5（NaOH调，初始PH值较低）高温高压灭菌，室温储存9)Detectionbuffer（200ml）：Tris-HCl（0.1M），2.422g；NaCl（0.1M），1.16g；PH=9.5（1MHCl微调）高温高压灭菌，室温储存操作方法1）DNA的提取（CTAB大量提取法）2）DNA的纯化①每管DNA平均分成2-3管，分别补水至500μl。②加250μlTris平衡酚（取下层）和250μl氯仿/异戊醇（24:1），温和混匀，静止5min，12000rpm离心5min③取上清液于另一干净1.5ml离心管中，加500μl氯仿/异戊醇（24:1），温和混匀，静止5min，12000rpm离心5min④在另一干净1.5ml离心管中加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc，将上清液转移到其中，温和混匀，-20℃沉淀30min，4℃离心，12000rpm，10min⑤70﹪乙醇洗沉淀2次，晾干后溶于200μlddHO（视DNA的量而定）23）标记探针①用目的基因的质粒做PCR，按试剂盒进行胶回收，要保证回收浓度尽量高，回收产物用以标记探针。②取回收产物16μl，置沸水中煮沸10min，冰中1号溶液（1号溶液再吸取加入到上管中，混匀，最后37℃标记20h，18-20h后根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，地高辛标记的对照DNA（2号管）应该1ng/μl。标记的探针及对照2号溶液的2-9号管分别取1μl点在尼龙膜上（距在1cm以上），（原标记产物1号仍放于37℃继续标记）紫外交联骤冷5min，加入4μl试剂盒里的拿出后先混匀，瞬时离心），于③将间1200×100μJ/cm2，1min后显影④洗膜及显色BlockingSolution:6号溶液/Maleicacidbuffer(1:10)(试剂盒中的6号溶液可放于37℃温浴化开)，现用现配。AntibodySolution:4号溶液/BlockingSolution（1:5000），4号溶液要10000rpm离心5min，吸取表面的液体。4℃可保存12小时。Color-substratesolution：40μlNBT/BCIPstocksolution(5号溶液，需避光)，2mlDetectionbuffer，现用现配，避光保存。下列操作均在脱色摇床上进行：Maleicacidbuffer15-25℃摇动2min；30min；10mlBlockingsolution10mlAntibodysolution30min；10mlWashingbuffer10mlDetectionbuffer2×15min；5min2mlColor-substratesolution避光显色1-2h④终止探针反应将标记适当时间的探针65℃水浴10min终止其反应，-20℃保存备用。4）酶切及酶切产物的回收①酶切估算DNA的量，每个样品取50-60μgDNA，平分成两管，每管分别用400μl的体系进行双酶切（选用的Sac1）：内切酶应为该基因中没有该酶的酶切位点，此选用酶切体系：成分用量（μl）DNA25-30μg内切酶Sac1Buffer11040TOTAL400酶切时先加一种酶及相应的buffer，37℃水浴5h后再补另一种酶及buffer，过夜酶切（在加第二种酶前先电泳检测第一种酶的酶切情况，过夜酶切后再电泳检测酶切情况，若没有切开，应补些内切酶以及Buffer）②回收酶切产物由于电泳时点样孔加样量有限，所以要对酶切产物进行回收，目的是缩小酶切产物体积，以便点样。在400μl的酶切产物中加2倍体积（800μl）预冷的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc，温和混匀，-20℃沉淀30min，4℃离心，14000rpm，15min，弃上清，70％乙醇洗沉淀两次。吹干，加40μlddH2O，溶后加5μl6×Lodingbuffer，瞬时离心。将同一样品的两管合为一管，待电泳（可在-20℃保存）。质粒的酶切产物作为正对照，质粒可做单酶切或双酶切，体系如下：用量（μl）成分质粒DNA3内切酶Sac1Buffer10.52TOTAL205）电泳试剂和仪器：0.8﹪的琼脂糖凝胶、15kmarker；电泳仪操作过程：按下列顺序点样：marker25μl，正对照10μl+10μl6×Loding，负buffer对照（10μl6×Lodingbuffer），DNA(80μl+10μl6×Loding。0.buffer)8﹪的琼脂糖凝胶（尽量厚些），10-20V电泳2-3cm后可逐渐加大电压；或者15V过夜电泳亦可。6）转膜利用毛细管作用原理向下转膜（操作约3h），电泳结束后应立即进行转膜试剂和仪器：脱嘌呤缓冲液——使DNA产生缺口，将提高转移的质量变性缓冲液——使DNA由双链变成单链，以便与探针结合中和缓冲液——与变性缓冲液中和，起到平衡作用2×SSC——用于浸湿3MM滤纸和尼龙膜；20×SSC、ddH2O托盘、吸水纸、3MM滤纸、尼龙膜、纱布、平板、盛溶液的容器、移液枪操作步骤：①切胶：将周围无用的胶切去，切除右上角做标记；②切好后进行洗胶：（在脱色摇床上进行）脱嘌呤缓冲液洗10-20min，至溴酚蓝变为黄色（此处不应超过20min），ddH2O洗2次变性缓冲液洗2×15min，ddH2O洗2次洗2×15min同时，将剪好的尼龙膜浸20×SSC平衡凝胶10min中和缓冲液泡于ddH2O中30min，30min后用2×SSC浸泡③压膜：（从下往上）托盘，大的吸水纸，与膜等大的吸水纸，4层干燥的2层用2×SSC浸湿的3MM滤纸，尼龙膜（正面朝上，ddH2O浸泡30min后浸于2×SSC中），封口膜，胶（正面朝上），2层用2×SSC浸湿的3MM滤纸，盐桥（用20×SSC润湿的纱布，一定要拉平），用平板盖在上面。4℃保鲜。3MM滤纸，转膜结束后若不能及时进行杂交可将膜紫外交联后置于7）预杂交及杂交试剂和仪器：10×SSC、预杂交液（42℃预热的7号溶液）、杂交液（7号溶液+探针）；紫外交联仪、杂交炉操作步骤：①紫外交联：（放在用10×SSC浸湿的3MM滤纸上（正面朝上），紫外交联②预杂交：（是为了将膜上没有DNA的部分封交联后，膜用ddH2O润洗两遍，自然晾干后，背面紧贴管壁放于干净的杂交管中，液（100cm2加10ml预杂交量），缓慢将膜润湿且避免气泡的产生，将两个杂交42℃预杂交2-4h。目的是为使DNA能更牢固地结合在膜上）将膜取下目的闭）加入预热的预杂交液，按膜的大小比例计算预杂交液的管对称地放于杂交炉中，③杂交：将标记好的的探针取出，煮沸5min，立即置于按照膜的大小比例（液，放于杂交炉中3.5ml/100cm2）加入预热的杂交40h以上。（交液