第八讲 DNA甲基化与组蛋白修饰2010

DNA甲基化

与

组蛋白修饰佳木斯大学2010/03基因表达模式一个多细胞生物机体的不同类型细胞相同的基因型不同的表型

表观遗传是指在DNA序列没有发生变异的情况下，基因表达的可遗传的改变。它主要通过对DNA或组蛋白的共价修饰（如DNA甲基化，组蛋白乙酰化），同源性的基因沉默（即一个基因被另一个与其同源的基因所抑制），副突变(paramutation)和亲本印迹，RNA编辑，蛋白异构体引起类似显性遗传等机制而产生的。表观遗传修饰

DNA甲基化(DNAmethylation)组蛋白修饰(histonemodifications)染色质重塑(chromatinremodeling)基因组印记(genomicimprinting)RNA相关沉默(RNAinterference)隔离子(insulator)、边界(boulidary)、核区室化(compartment)副突变(paramutation)位置效应(positioneffectvariegation)X染色体剂量补偿(X-chromosomedosecompensation)提纲组蛋白的甲基化；组蛋白的乙酰化；组蛋白乙酰化的生物学意义；DNA甲基化；DNA甲基化与医学。在最近的几年，我们对异染色质的认识有了长足的进展，发现一些生化修饰对于异染色质的形成及其逆转和DNA的转录起到关键作用。这些修饰主要包括组蛋白修饰（包括甲基化、乙酰化、磷酸化等）和DNA的甲基化。

核小体是真核细胞染色质的基本结构单位。每个核小体由4种核心组蛋白构成异源八聚体和缠绕在八聚体之外的约200bp的DNA组成。这种结合是依靠作用于DNA磷酸骨架小沟区的静电引力来实现的。由于静电引力的作用，DNA链围绕组蛋白形成螺旋和扭曲，这恰好使DNA双螺旋的小沟区连成一条沟道，组蛋白弯曲的尾巴得以穿过其中，于核小体外与DNA作用，更加稳定了核小体的结构。但是，核小体的结构也成为各类转录因子与DNA结合的主要障碍。越来越多的实验证据表明，染色质和核小体构型的改变在转录的起始中起到重要的调控作用。现已知有３种机制参与染色质构型的改变：①依赖于ATP的染色质重构；②组蛋白移位；③染色质的共价修饰（covalentchromatinmodification）。其中染色质的共价修饰既可发生在DNA上也可发生在组蛋白上。DNA的修饰主要是胞嘧啶的甲基化，而组蛋白的共价修饰则包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP—核糖化，由此构成多种多样的组蛋白密码。不同的调节机制间互相串换，以一种共同协作的状态来完成对染色质结构的调控。组蛋白的翻译后修饰组蛋白的甲基化（methylation）；组蛋白核糖基化(ribosylation)

；组蛋白的乙酰基化（acetylation）；组蛋白磷酸化（phosphorylation）；组蛋白泛酸化（obiquitination）。每个组蛋白都有进化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。组蛋白乙酰化／去乙酰化在真核生物染色质核小体中的组蛋白，其N末端氨基酸残基可发生乙酰化等共价修饰。组蛋白的乙酰化是一可逆的动态过程，而其稳定状态的维持则是多种组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和去乙酰基酶（HDACs）共同作用的结果。这种可逆的乙酰化修饰作用可使染色质结构发生动态的改变，并对基因的转录产生相应的影响。赖氨酸引入乙酰基乙酰基转移酶去乙酰化酶组蛋白乙酰化对染色质结构及

基因转录的影响组蛋白乙酰化引起染色质结构改变及基因转录活性变化的机制至少包括以下几个方面：①组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化能够使组蛋白携带正电荷量减少，降低其与带负电荷的DNA链的亲和性，导致局部DNA与组蛋白八聚体解开缠绕，从而促使参与转录调控的各种蛋白因子与DNA特异序列结合，进而发挥转录调控作用；

②组蛋白的Ｎ末端尾巴可与参与维持染色质高级结构的多种蛋白质相互作用，更加稳定了核小体的结构。而组蛋白乙酰化却减弱了上述作用，阻碍了核小体装配成规则的高级结构（如螺线管）；③组蛋白乙酰基转移酶对相关的转录因子或活化因子进行乙酰化修饰以调节基因的表达。局部乙酰化和广泛乙酰化模式

组蛋白乙酰化状态呈多样性。与启动子结合的激活因子可募集相应的HATs引起局部组蛋白的乙酰化；而增强子或基因座位控制区LCR结合的活化因子则可募集HATs引起广泛乙酰化。广泛乙酰化使组蛋白维持在一个较高的乙酰化水平，干扰染色质高级结构的折叠，使其不能形成紧密的结构。因此推测，广泛乙酰化为基因表达建立了一个稳定的基础；而局部乙酰化则是基因对细胞外信号的瞬时反应。组蛋白去乙酰基酶

组蛋白乙酰化为一可逆过程，乙酰化和去乙酰化的动态平衡控制着染色质的结构和基因表达。迄今为止，已有很多种类的组蛋白去乙酰基酶（HDACs）在不同的物种中被鉴定出来，它们具有不同的功能。人的HDACs主要分为3类。HDACs与HATs一样也存在于复合物中，复合物形式可调节其本身的酶活性。

HDACs在转录抑制中具有重要作用。HDACs抑制基因转录的分子机制主要是靠某些转录因子与DNA序列结合后，募集HDACs并与之形成转录复合物，HDACs作用于相应的组蛋白而调节基因转录。虽然HDACs主要抑制基因的转录，但最近的研究显示酵母的第一类去乙酰基酶Hos2参与基因的活化。在真核细胞中，组蛋白乙酰化／去乙酰化对染色质结构及基因转录的调控可能是一个多层次、多步骤的复杂过程。对这一领域的研究对于进一步阐明基因表达调控的机制，明确肿瘤等相关疾病发病的分子机制以及治疗方法等方面有着重大的意义。组蛋白的甲基化

组蛋白的甲基化（histone

methylation）由组蛋白甲基转移酶介导催化。甲基化修饰通常发生在组蛋白的N端尾部结构域。甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控方面。最重要的效应之一就是导致基因的转录功能丧失。甲基化位点多位于H3、H4的赖氨酸和精氨酸残基上，组蛋白H3氨基尾段上的K4和K9便是其中的两个甲基化的常发位点。不同位点上甲基化，由不同的酶所负责。目前发现24个组蛋白甲基化位点，其中17个位于赖氨酸，其他7个位于精氨酸。赖氨酸可以是单甲基化、双甲基化和三甲基化，精氨酸也可以是单甲基化或者双甲基化。如果把这3种甲基化状态都考虑在内，应该一共有3×1011种组蛋白甲基化组合状态，复杂的组合为组蛋白甲基化发挥功能调控作用提供更大的潜能。过去发现一些组蛋白可以快速的乙酰化，然后又去乙酰化以使基因表达受到调控。但是，人们一直都认为甲基化作用是一种不可逆的过程。最新的研究发现，甲基化作用是可逆的，组蛋白可以发生去甲基化作用。有一种酶会对组蛋白中赖氨酸和精氨酸甲基化作用进行去除。这重新定义了组蛋白甲基化的本质，同时也让组蛋白修饰通路更加复杂化了。哈佛大学的分子生物学家施洋及其同事在2004年12月16日的《细胞》杂志网络版上报告：他们发现了一种组蛋白去甲基酶，命名为"赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1)"(lysine-specificdemethylase1)。这种酶能使某种组蛋白尾部的一个氨基酸--赖氨酸失去甲基。某些类型的白血病、结肠癌等疾病，被认为可能与错误的甲基化过程有关，组蛋白去甲基酶可能成为颇有潜力的药物标靶。甲基转移酶去甲基酶使组蛋白失去甲基ShiYJ,LanF,MatsonC,etal.HistonedemethylationmediatedbythenuclearamineoxidasehomologLSD1.Cell,2004,119(7):941～953

SET结构域存在于许多与肿瘤发生相关的人类基因之中。过去10年的研究发现，具有此结构域的基因多数都发挥肿瘤抑制的功能。最近发现组蛋白甲基转移酶也具有SET结构域，那么很自然地推测组蛋白甲基转移酶是否也具有肿瘤抑制的功能？

组蛋白甲基化与疾病

RIZ1(PRDM2)具有H3K9位甲基转移酶活性。研究发现，在某些肿瘤中，例如：乳腺癌、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、脊髓瘤、肺癌和骨肿瘤中，该基因发生突变而失去活性，而其失活又引起G2-M期的细胞周期延长，调亡抑制，因此推测H3K9位组蛋白甲基转移酶可能具有肿瘤抑制功能，它的功能缺失可能参与癌症的发生有关。最近，美国一项临床研究发现，组蛋白甲基化在前列腺癌患者标本中比例很高，估计其他肿瘤中也可能有相似发现。另外，还有报道缺乏甲基的饮食会导致组蛋白甲基化程度低，这类人群发生肿瘤的比例较正常人群高.这也提示组蛋白甲基化可能与肿瘤发生有关。组蛋白甲基化研究尚处起步阶段，不同甲基化位点的具体功能还没有明确。组蛋白甲基化与其他表观遗传学修饰方式的关系尚未涉及。异常甲基化与肿瘤和其他疾病的关系也未阐明。缺乏甲基的饮食导致肿瘤的具体机制依然不清楚。组蛋白去甲基化酶的具体功能和作用机理仍需进一步探讨，其他新的去甲基化酶也丞待发。随着组蛋白甲基化研究的深入，必将为分子生物学、遗传学和肿瘤学的发展提供新的思路。组蛋白密码染色体的多级折叠过程中，需要DNA同组蛋白(H3、H4、H2Ａ、H2B和H1)结合在一起。研究中，人们发现组蛋白在进化中是保守的，但它们并不是通常认为的静态结构。组蛋白在翻译后的修饰中会发生改变，从而提供一种识别的标志，为其它蛋白与DNA的结合产生协同或拮抗效应，它是一种动态转录调控成分，称为组蛋白密码(histonecode)。所谓组蛋白密码就是对结合DNA的组蛋白进行一系列修饰,从而影响某些基因何时以及以何种方式被打开或关闭。组蛋白密码信息存在于转录后组蛋白修饰等过程中，这些修饰的多样性、整体性及生物学功能的多样性表明存在这样一种组蛋白密码。组蛋白修饰作为一种重要的表观标志，与其他表观标志之间也存在一定的联系，构成了一个复杂的网络。组蛋白密码大大丰富了传统遗传密码的信息含量。组蛋白氨基末端的多样化修饰扩充了遗传密码的信息库。这种常见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等等，它们都是组蛋白密码的基本元素。与DNA密码不同的是，组蛋白密码在动物、植物和真菌类中是不同的。我们从植物细胞保留有发育成整个植株的全能性和去分化的特性中，就可以看出它们在建立和保持表观遗传信息方面与动物是不同的。在组蛋白的修饰中，乙酰化、甲基化研究最多。乙酰化修饰大多在组蛋白H3的Lys

9、14、18、23和H4的Lys

5、8、12、16等位点。对这两种修饰结果的研究显示，它们既能激活基因也能使基因沉默。甲基化修饰主要在组蛋白H3和H4的赖氨酸和精氨酸两类残基上。研究也显示，在进化过程中组蛋白甲基化和DNA甲基化两者在机能上被联系在一起。每个组蛋白都有进化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。一般来说，组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。乙酰化修饰和甲基化修饰往往是相互排斥的。在细胞有丝分裂和凋亡过程中，磷酸化修饰能调控蛋白质复合体向染色质集结。细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都会涉及到染色质活性的改变，这一改变就是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现的。既然几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能反应相应的特定生物学过程。组蛋白修饰的生物学意义细胞对外在刺激作出反应，多数是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现的；染色质的转录活性与组蛋白修饰相伴；有丝分裂过程也与特异性组蛋白修饰有显著的相关性；组蛋白修饰还参与DNA损伤和凋亡。研究组蛋白密码对药物开发具有战略意义，多种组蛋白修饰酶已成为相关疾病治疗的靶目标。比如，组蛋白去乙酰酶（HDACs）抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤；探讨遗传调控和表观遗传调控相互作用的网络与不同生物学表型之间的关系；组蛋白修饰的生物学意义DNA甲基化DNA甲基化（DNA

methylation）是最早发现的DNA修饰途径之一，也是DNA的一种天然修饰方式，广泛存在于细菌、植物和哺乳动物，具有重要的生物学意义。

DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化所致的转录抑制的可能机制DNA甲基化

甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段。在脊椎动物中，CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，人们将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛(CpGisland)，通常长度在1kb～2kb左右。在真核细胞中，DNA甲基化使得胞嘧啶环5碳的位置添加一个甲基，这个发生在5′-ＣＧ-3′序列(也称作CpG二核苷酸)中的反应受DNA(5-胞嘧啶)甲基转移酶[methyltransferase,DNAMTase]的催化。这是最常见的真核性DNA修饰。这种现象在植物和动物中都广泛存在，它在正常发育和组织特异的基因表达中起重要作用。

DNA甲基化的主要形式

胞嘧啶甲基化形成5-甲基胞嘧啶，腺嘌呤甲基化形成N6-甲基腺嘌呤和鸟嘌呤甲基化形成7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。

DNA甲基化的主要形式胞嘧啶5-甲基胞嘧啶腺嘌呤N6-甲基腺嘌呤鸟嘌呤7-甲基鸟嘌呤5-甲基胞嘧啶N6-甲基腺嘌呤7-甲基鸟嘌呤

在人类基因组DNA中，约3％～4%的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在。大约70％～80％的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核苷酸集中的区域称之为CpG岛，这些CpG岛跨过许多基因的5’末端—包括启动子、未翻译区和第一外显子。CpGislands

由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CpGislands，大多位于转录单元的5'区。

未甲基化的CpG岛与看家基因相关，而某些组织特异性基因会出现甲基化的CpG岛。DNA甲基化与人类细胞DNA的表达相关，建立在基因表达基础上的信息遗传被分类为表观遗传学，这与建立在基因序列基础上的信息遗传即遗传学不同。人类表观遗传学主要的改变就是定位在CpG岛内的胞嘧啶甲基化以及组蛋白的修饰。DNA甲基化酶

催化DNA甲基化过程的是DNA甲基化转移酶（DNMT）。根据催化反应类型，可以将DNMT分为三类，但在高等真核生物中只发现了第三种类型的酶，即DNAC5胞嘧啶甲基转移酶，即通常所说的DNMT，又称DNA甲基转移酶，它可以催化将叶酸、甲基钴铵素等甲基供体提供的甲基集团转移至胞嘧啶5位碳上形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化转移酶两种甲基化酶

DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT),真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型（mainte-nance）甲基转移酶，另一种是从头合成（denovosynthesis）甲基转移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。日常型甲基转移酶日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。DNA甲基转移酶

将甲基转移至胞嘧啶环的酶称为胞嘧啶5-甲基转移酶或DNA甲基转移酶。1988年第一次从小鼠基因克隆出真核DNAMTase基因，称为Dnmt1，这个基因在真核生物中高度保守。DNAMTase作用的靶位点是DNA中回文结构的二核苷酸CG(CpG)。

在新近复制的DNA分子中,DNA呈半甲基化状态，即亲链甲基化、子链未甲基化。哺乳动物DNA甲基转移酶与这种半甲基化底物有高度亲和性。在体外实验中也能够使未甲基化底物重新甲基化(denovomethylation)。

去甲基化酶

去甲基化酶(DNAdemethylase，dMTase)有两种类型：位点特异性去甲基化酶和总基因组DNA去甲基化酶。两者是一致的，与发育和肿瘤发生中基因的活化有关。总DNA去甲基化酶与整个的去甲基化过程有关。DNA甲基化状态通过从头甲基化、维持甲基化和去甲基化3个过程受到调节。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组DNA各CpG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱，组织特异的DNA甲基化谱是哺乳动物基因组的显著特征。组蛋白乙酰化和DNA甲基化

组蛋白乙酰化和DNA甲基化是调控基因表达的两种主要方式，目前认为组蛋白乙酰化和DNA低甲基化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化和DNA高甲基化可抑制基因表达。组蛋白乙酰化和DNA甲基化这两种分子机制相互协调，实现基因表达的精细调控。DNA甲基化转移酶组蛋白去乙酰化酶DNA甲基化去乙酰化组蛋白染色质重塑组蛋白的乙酰化状态控制DNA甲基化，组蛋白低乙酰化可促进DNA甲基化，组蛋白高乙酰化可抑制DNA甲基化。甲基化的DNA序列可募集HDACs，后者引起组蛋白去乙酰化，组蛋白去乙酰化又可引发DNA甲基化，这种模式导致一种稳定的基因抑制状态。组蛋白乙酰化和DNA甲基化这两种机制相互协调，实现基因表达的精细调控。DNA甲基化生物学意义在哺乳动物，甲基化是DNA最常见的复制后调节方式之一，是正常发育、分化所必需的，具有重要的生物学意义。DNA甲基化对生物遗传信息进行调节，在基因表达调控、发育调节、X染色体失活和基因组印迹等方面发挥重要作用，甲基化异常还与肿瘤发生有关。DNA甲基化修饰的生物学功能

参与基因的表达调控

参与真核生物胚胎发育调节

基因组印记

X染色体的失活

与细胞分化和增生有关

DNA甲基化与肿瘤

(一)参与基因的表达调控

一般来说，DNA甲基化与基因表达呈负相关，甲基化可以抑制转录起始，但并不阻止转录的延伸。这种抑制需要关键位点的甲基化，并不需要全面的甲基化，也不存在启动子甲基化的阈值。但是，甲基化位点与转录起始点的相对位置对转录抑制是至关重要的。

DNA甲基化能抑制基因表达的机制可能是甲基DNA分子的大沟中突出，而大沟正是众多蛋白质因子与DNA结合的部位，这样就阻止了转录因子与基因的相互作用。DNA甲基化作为细胞核防御体系的组成部分，可以灭活一些潜在的危险DNA序列，抑制寄生序列和前病毒DNA的活动。(二)参与真核生物胚胎发育调节

受精卵中来自亲本的两套染色体具有不同的甲基化图谱，但这些甲基化在发育过程中迅速丢失。及至桑椹胚时，所有被检测的CpG位点均已发生甲基化，这种状态一直维持到囊胚期。当发育到前肠胚时，上述位点又重新甲基化，并以此奠定了成体甲基化的基础。

这种在生物胚胎发育的不同阶段所发生的广泛去甲基化及随后发生的重新甲基化，可能是为了使胚胎消除其亲本特异的甲基化谱，这样才能使胚胎进入正常的发育阶段。DNA的甲基化的修饰可以使某些特定组织或特定细胞里的一些不必要的基因不表达。而在特定时期又可通过去甲基化的修饰来表达该基因，从而调节胚胎发育。

在哺乳动物的植入前发育中，卵母细胞和精子DNA上截然不同的遗传外标记被重塑成一种胚胎模式。早期胚胎的遗传外重新编程过程抹去了配子从亲本遗传下来的特异甲基化模式。这个基因的广泛去甲基化过程可能对多能干细胞的形成过程起关键性的作用，这些多能干细胞对以后的发育很重要。在植入后的发育过程中，又发生了重新甲基化，基因组DNA在限定的发育时间和特异的位点被甲基化。遗传外修饰的另一去甲基化/重新甲基化事件发生在生殖细胞发育期，这是重建基因组印记所必需的。为使高度特化的精子和卵母细胞能重新恢复发育的全能性，或使那些已按分化途径分化为特定功能的体细胞恢复发育的全能性，遗传外重新编程是必不可少的，其中DNA的甲基化和去甲基化是重要的步骤之一。

（三）基因组印记

基因组印记(imprinting)是指基因保留其配子的某些特征并进行选择性差异表达，此与胚胎发育有关。大多数印记基因可以调节胚胎的生长和发育。印记功能的紊乱将导致多种发育异常甚至死胎。基因组印记的特征是亲本特异基因的表达，这种印记在生殖细胞发育过程中即已建立，以便用于区别印记基因的亲本来源。基因组印记是一种特别的非孟德尔遗传现象，即来自双亲的等位基因在子代中的差异性表达，是遗传后的基因调控方式，主要与基