免疫学检测原理防治

1免疫学检测原理和免疫学防治王平章2015年6月12日2教学要求掌握抗原抗体反应的特点掌握ELISA的基本原理熟悉检测体液免疫和细胞免疫的常用方法了解免疫学检测方法的应用熟悉疫苗的种类及发展方向了解免疫学防治的措施3第二十二章免疫学检测技术4免疫学检测技术习惯上，将利用未做修饰的抗原、抗体以及补体进行的相关检测方法，称为经典免疫学技术，如凝集反应、沉淀反应等血清学检测技术将利用各种标记的抗原或抗体、以及利用辅助工具如流式细胞术开展的检测技术,免疫细胞技术等，习惯上归属为现代免疫学技术5免疫学检测技术抗原抗体反应的原理,特点及影响因素常见的检测抗原或抗体的体外试验免疫细胞功能检测6第一节体外抗原抗体反应（血清学反应）7

抗原抗体反应的原理抗原的抗原决定基与抗体的结合部位之间的结构具有互补性，二者相互结合后，在适宜的条件下，可出现可见反应。

Ag2

Ag1Ab8抗原抗体反应的特点高度特异性可逆性依赖一定的抗原、抗体浓度及比例抗原抗体反应呈现的两个阶段91、高度特异性指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。特异性由抗原表位与抗体的CDR(complementarity-determiningregion)互补结合所决定。

Ab10人血清中的抗体是具有多样性思考：Ig多样性的分子机制？11抗体的特异性是免疫学检测技术的基础各种检测Westernblotting

ImmunofluorescenceELISAELISPOTProteinmicroarray诊断,预防,治疗122、抗原抗体反应的可逆性抗原抗体的结合主要是分子表面的非共价结合，稳定，但在适当条件下可以解离，各自生物学特点不变。13抗体纯化、免疫亲和层析AgarosebeadsAgarosebeads14免疫(共)沉淀AgarosebeadsAg/Bait免疫沉淀-Immunoprecipitation(IP)免疫共沉淀-Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Prey目的抗原蛋白质复合物15magneticparticles/beadsCD19Bcell磁珠分选细胞16AbexcessAgexcess3、适宜的抗原抗体浓度和比例Equivalence–Latticeformation抗原、抗体在一定浓度和比例时可出现肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）；比例合适、颗粒性抗原，或IgM易形成大分子IC。实践中，需要调整两者的比例，如倍比稀释的方式，避免假阴性。思考：中等大小IC的病理意义？174、抗原抗体反应的两个阶段特异性结合阶段迅速，数秒至数分钟内完成，一般无肉眼可见的反应(肉眼)可见反应阶段IC之间靠电荷作用聚集，数分钟-数天不等。思考：现代免疫检测技术的优势？18请勿超过MAX线MAX线阳性无效阴性胶体金免疫层析法（胶体金标记技术+免疫层析）19Anti-HCG(Ab1)胶体金标记CTHCGAnti-HCG(Ab2)Anti-Ab1(Ab3)20抗原抗体反应的影响因素1、电解质2、温度:37℃3、酸碱度:pH6-8之间21第二节检测抗原和抗体的体外试验22检测抗原或抗体的方法传统血清学反应直接凝集反应间接凝集反应单向琼脂扩散双向琼脂扩散免疫标记技术免疫酶测定法免疫荧光技术放射免疫测定法免疫印迹技术，等经典免疫学技术现代免疫学技术23凝集反应(agglutinationreaction)24直接凝集反应++++++++++-ABO血型鉴定菌种鉴定、血清型鉴定25葡萄球菌乳胶凝集试剂盒D群链球菌乳胶凝集试剂盒大肠杆菌O157乳胶凝集试剂盒链球菌乳胶凝集试剂盒李斯特氏菌乳胶凝集试剂盒艰难梭状芽孢杆菌乳胶凝集试剂盒弯曲杆菌乳胶凝集试剂盒金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒间接凝集反应(反向)聚苯乙烯乳胶颗粒26可溶性抗原，液体或半固体琼脂凝胶中进行在液体中形成沉淀环和絮状沉淀凝胶中沉淀反应单向琼脂扩散双向琼脂扩散免疫电泳沉淀反应(precipitationreaction)27免疫标记技术

(immunolabelingtechnique)用放射性核素、酶、荧光素等示踪剂标记抗原或抗体后进行抗原抗体反应灵敏度高、快速；可用于定性、定量、定位分析等。改变的是抗原抗体反应的可见方式，并不改变反应的本质及特点28免疫酶测定法

(enzymeimmunoassay,EIA)抗原抗体反应的高度特异性+酶对底物的高效催化作用酶联免疫吸附试验EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay,ELISA29酶联免疫吸附试验将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，常用于测定可溶性抗原或抗体，如检测血清、胸水、腹水、脑脊液、细胞培养上清等。酶标记抗原或抗体1酶分解底物产生有色物质2酶标仪对有色物质进行测定3通过光密度值（OD）评价抗体或抗原含量430

DirectELISA

IndirectELISASandwichELISA

CompetitiveELISA待检抗体待检抗原已知抗原已知抗体31思考：几个抗原抗体反应？32BAS-ELISA：生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem，BAS)ELISA的放大系统33免疫组化技术

(immunohistochemistrytechnique)利用标记的特异性抗体在组织/细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对抗原进行定位、定性和定量检测的技术。可在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。

标记物：酶（如HRP,AP）、荧光素、胶体金等组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片细胞标本：细胞爬片，细胞涂片，组织印片。34×200×200×400×400食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma)结肠腺癌(colonadenocarcinoma)35胃底腺黏膜36放射免疫测定

(radioimmunoassay,RIA)利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法敏感度pg水平,常用于检测微量物质胰岛素,生长激素,甲状腺素,吗啡,地高辛药物和IgE等.美国科学家耶洛(RosalynYalow)采用131I标记的胰岛素作为失踪剂，利用胰岛素与其特异性抗体之间的反应，建立了胰岛素的放射免疫测定法，而获得1977年诺贝尔生理或医学奖。37免疫荧光技术

(immunofluorescencetechnique)某些物质在特定波长范围内的光照下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。可标记抗原或抗体。38异硫氰酸荧光素藻红蛋白39可以用于检查细菌、病毒、螺旋体等抗原、抗体，帮助诊断传染病；也可以鉴定细胞表面的CD分子，检测AID的抗核抗体等。4041免疫印迹技术(immunoblotting,Westernblotting)将十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分离得到的按分子量排列的蛋白质转移到固相载体膜上，再利用标记（如酶、放射性核素、荧光素）的特异性抗体对蛋白质进行定性和定量分析的技术。广泛应用于生物、医学各领域。4243体内示踪44第三节免疫细胞功能的检测45T细胞功能B细胞功能CTL、NK细胞功能吞噬细胞功能免疫细胞的分离细胞因子测定46免疫细胞的分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)PBMC=lymphocyte+monocyte+DC47密度梯度离心-isolationofPBMC1.077g/ml离心后各细胞沉降于密度梯度液中与自身密度相同的密度平衡点1.075g/ml48免疫吸附法：抗体包被于聚苯乙烯培养板,加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞被贴附在培养板上，从而与其他细胞分开。免疫磁珠法(immunemagneticbead,IMB)：抗体与磁珠交联;magnetic-activatedcellsorting,MACS.荧光激活细胞分离仪分离法/流式细胞术分离法（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS）（flowcytometry,FCM）抗原特异性的CTL：抗原肽－MHC分子四聚体技术

淋巴细胞及其亚群的分离49免疫磁珠分离法antibodycoatedmagneticbeadsantigenpositivecellscellsuspensionantigennegativecellsdissociatingagentantigenpositivecellsseparatecellsinamagneticfield50流式细胞术(FACS/FCM)细胞被荧光标记

(Ab，荧光蛋白）单细胞排列被快速喷出细胞受激发产生散射光判定细胞是否需要分选细胞被赋予不同的电荷可同时测定多项参数可多色荧光组合使用(被荧光标记的单细胞悬液）5152流式细胞术操作流程样本收集及处理制备单细胞悬液免疫荧光染色上机检测数据分析53流式细胞术的应用细胞大小细胞颗粒度DNA含量RNA含量蛋白质含量细胞表面积核浆比例

……特异性抗原、受体细胞内的细胞因子蛋白质的修饰增殖/凋亡/存活状态pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位

……细胞结构细胞功能54SpleenThymus55抗原肽-MHC分子四聚体技术四聚体技术即MHC-I类分子-肽四聚体复合物标记CTL的流式细胞检测技术56免疫细胞功能测定T细胞功能测定B细胞功能测定CTL,NK细胞功能测定吞噬细胞功能测定57T细胞增殖试验形态计数法

增殖时体积增大，形态不规则，胞质增多，核松散，较多核仁3H标记的胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法/125I-UdR掺入法MTT法58MTT法3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐甲瓒淡黄色，可溶性蓝紫色，不溶性59迟发型超敏反应的检测

(delayed-typehypersensitivity,DTH)体内检测，细胞免疫功能皮试常用的生物性抗原：结核菌素、念珠菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶和腮腺炎病毒等。原理:

迟发型超敏反应/Ⅳ型超敏反应，产生以单个核细胞浸润和局部组织细胞损伤为主的炎症。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的可发生水肿，甚至坏死。60结核菌素试验

(包括OT-test和PPD-test两种试验)OT试验：旧结核菌素（结核杆菌培养液浓缩后的粗制品）PPD试验：纯蛋白衍化物（结核杆菌培养物的纯化制品）皮试48～72小时有红肿硬结>5毫米为阳性，否则为阴性正常人为弱阳性，即硬结直径为5～9mm20mm以上或局部皮肤发生水泡与坏死者为强阳性反应，提示可能有活动性感染61B细胞功能测定单向琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中IgG、IgA、IgM等各类Ig的含量。抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验检测（plaqueformingcelltest,PFCtest）脾脏细胞悬液+绵羊红细胞(SRBC)+补体62细胞毒试验（杀伤细胞活性检测）检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的技术，主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究CTL介导的细胞毒试验：常采用51Cr释放法NK细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞为K56263杀伤试验：Cr释放法64凋亡细胞检测法形态学检测FACS(FITC-AnnexinV选择性结合磷酯酰丝氨酸)梯状凝胶电泳TUNEL法（DNA断裂缺口中的3’-OH的原位标记）凋亡信号通路的活化状态Westernblot检测靶分子切割…晚期早期HeLaDNA电泳PS外翻65吞噬功能测定将吞噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质混合温育后，颗粒物质被吞噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映吞噬细胞的吞噬能力。巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验酵母聚糖(zymosan)吞噬试验zymosanphagocytosisbyhumanneutrophils66细胞因子的检测（1）生物活性检测法根据不同的细胞因子具有的不同的生物学活性，可采取相应的测定方法。①细胞增殖或抑制法：CTLL-2依赖IL-2；IL-1对黑色素瘤细胞A352具有抑制作用②细胞病变抑制法：干扰素抑制病毒感染细胞67（2）免疫学检测法①几乎所有的细胞因子都可以用ELISA（如双抗体夹心法）进行检测。②胞内细胞因子检测法（通常要用蛋白转运抑制剂处理，如BFA）③酶联免疫斑点试验（enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）产生细胞因子或抗原特异性的抗体分泌细胞的细胞频数检测68ELISPOT69计算斑点70第二十三章免疫学防治71疫苗的使用与疾病控制其他传染病：鼠疫、霍乱、梅毒、疟疾、狂犬病、肺结核…72许多疾病无有效疫苗病毒：HIV，疱疹病毒细菌：葡萄球菌，A组链球菌真菌：假丝酵母原生动物：疟疾，利什曼病蠕虫感染：血吸虫病…皮肤暗丝孢霉菌(phaeohyphomycosis)73疫苗开发策略的转变反向/逆向疫苗策略

(reversevaccinology)74灭活疫苗（死疫苗）减毒活疫苗类毒素疫苗亚单位疫苗结合疫苗联合疫苗重组载体疫苗DNA疫苗合成肽疫苗食用疫苗…现代疫苗种类