荧光法测定核黄蛋白

荧光法测定核黄蛋白-核黄素的解离常数李俊;张冬梅;陶力【摘要】@@本文推荐一个用荧光法测定配合物解离常数的实验，实验原理简单,知识内容跨学科，兼有生物化学和化学知识，有利于生化专业和化学专业的学生知识面的拓宽.【期刊名称】《大学化学》【年(卷)，期】2000(015)003【总页数】3页(P39-41)【作者】李俊涨冬梅;陶力【作者单位】南京大学生物化学系，江苏,210093浦京大学生物化学系，江苏,210093;南京大学生物化学系，江苏,210093【正文语种】中文［中图分类】O6本文推荐一个用荧光法测定配合物解离常数的实验，实验原理简单，知识内容跨学科，兼有生物化学和化学知识，有利于生化专业和化学专业的学生知识面的拓宽。1实验目的掌握用荧光法测定配合物解离常数的原理和方法；熟悉荧光光度计的使用。2实验原理核黄素(riboflavin,Rf)，又称维生素B2，它是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)这两种辅酶的前体，广泛参与体内生物氧化还原反应，能促进糖、脂和蛋白质的代谢。核黄素的水溶液具有荧光，在一定的浓度范围内，荧光强度与核黄素含量成正比，可用于定量测定。在鸡蛋清中存在一种蛋白质核黄蛋白(riboflavin-bindingprotein,RfBP),分子量为36000[1]，它能与核黄素按1:1的比例结合：核黄蛋白与生成的配合物核黄蛋白-核黄素都不具有荧光。因此，当用核黄蛋白去“滴定”核黄素时，核黄素的荧光强度就会减弱，这种现象叫做〃荧光猝灭”。以荧光强度对核黄蛋白加入量作图，就可以得到核黄蛋白的“滴定”曲线(图1),根据这个“滴定”曲线，可以计算出该配合物的解离常数Kd。通常是分别求出每个实验点的Kd，然后求平均值[2]。这里，我们采用作图法来求该配合物的解离常数，方法如下：将曲线的直线部分延长交横轴于A点，此点表示RfBP与Rf恰好等摩尔反应。但由于配合物的解离，使得此时的荧光强度不为零，而是在图中B点处对应的荧光强度巳荧光增加的程度取决于配合物的稳定性。设配合物不解离时在A处的浓度为c，配合物的解离度为a,则a=F7F,平衡时[RfBP・Rf]=(1-a)c[RfBP]=ac[Rf]=ac则配合物的解离常数Kd=[RfBP][Rf]/[RfBP・Rf]=a2c/(1-a)=(F7F)2・c/(1-F'/F)式中c为核黄素的浓度(nmol/L);F为加入核黄蛋白前溶液的荧光强度(即总的游离核黄素的荧光吸收)；『为曲线上读出的荧光强度(即溶液中游离的核黄素的荧光吸收)。3材料和仪器实验中使用的材料为鸡蛋和透析袋(分子量不超过20000)；仪器为磁力搅拌器、低速离心机(5000r/min)和930型荧光光度计。4试剂6mmol/LHCl。0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5):6.07gTris用少量蒸馏水溶解，加入40mL1mol/LHCl,再用蒸馏水稀释至1000mL。⑶核黄素贮备液：准确称取核黄素18.0mg,用少量蒸馏水溶解，加入1mL浓盐酸并用蒸馏水稀释至500mL。放置于冰箱中避光保存，两个月内有效。⑷核黄素标准溶液(180pg/L):将核黄素贮备液用蒸馏水稀释200倍。5实验内容5.1核黄蛋白的制备［2］将鸡蛋壳敲破，小心倒出蛋清。加入等体积的蒸馏水(约25mL),磁搅拌10min后再离心10min(4000r/min)。上清液用20倍体积的6mmol/LHCl透析24h。再于20倍体积的0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)中透析24h［注］在鸡蛋清中，核黄蛋白通常是以与核黄素结合成配合物的形式存在，在低pH下(小于4.0),核黄蛋白与核黄素分离，在高pH下(大于4.5)，核黄蛋白又能与核黄素结合，而蛋清中的其他蛋白质均无此活性［3］。因此，在本实验中，利用6mmol/LHCl将溶液的pH降至4.0以下，核黄蛋白与核黄素发生分离，通过透析将游离的核黄素和其他小分子除去而核黄蛋白留在透析袋中。核黄素在鸡蛋清中的含量很少，而在蛋黄中含量较多，其主要存在形式也是蛋白质结合物。通常情况下，核黄蛋白能将鸡蛋中沉积的核黄素以配合物的形式储存，在需要时(如鸡蛋孵化过程中)再通过一定的生物代谢过程将核黄素释放出来。，两次透析均在4°C下进行(4°C的冷藏柜)。在透析过程中，有部分的变性杂蛋白沉淀下来，透析完后将袋内的溶液离心10min(4000r/min),弃去沉淀，取上清液即得核黄蛋白溶液，将此溶液用蒸馏水稀释2倍后于4C保存备用。5.2核黄素-核黄蛋白配合物的解离常数的测定取11支试管，按表1进行操作。核黄素见光会分解，因此实验过程中应注意避免核黄素受阳光直接照射。加入核黄蛋白溶液，混匀后立即进行荧光测定。核黄素的激发波长为460nm,发射波长为520nm。因此可选用带通型400nm(蓝色)滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm(红色)滤色片为发射光滤色片。按照荧光光度计的使用说明调节仪器，以第一支试管作为参比溶液，调节荧光强度读数至满刻度(100%)，然后依次测定各管的相对荧光强度Fi，并将测定结果填入表1。以相对荧光强度为纵坐标，加入的RfBP的体积(mL)为横坐标，绘制〃滴定”曲线(图2)。将水平渐近线反向延长交纵轴于C点，对应的荧光强度为F0，则解离度可用下式计算：a=(F'-F0)/(F-F0)由此求出配合物的解离常数Kd。表1核黄素-核黄蛋白配合物的解离常数的测定试管号V(核黄素标准液)/mLV(Tris-HCl缓冲液)/mLV(RfBP)/mLFi0123456789103.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.02.952.902.852.802.752.702.652.602.552.500.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50图1核黄蛋白的理论“滴定”曲线图2核黄蛋白的实际“滴定”曲线6结果与讨论实际的测量过程中，当核黄蛋白过量时，荧光强度并非趋近于零，而是趋近于一条平行于横轴的直线（图2）,与理论曲线有一定的差别。这可能是由以下两个原因造成的:①核黄蛋白与核黄素结合后，荧光并未被完全猝灭；②当核黄蛋白过量时，由于过量的核黄蛋白而产生一定的散射效应，这使得荧光发射大于零，即有一定的荧光背景，因此需要扣除由此产生的相对荧光强度。实验中发现，当核黄蛋白过量至一定程度时（加入0.8mL），荧光发射有增大的趋势，这证实了上面的推测。实际测得配合物的解离度a为0.049,Kd值为1.20x10-9mol/L,与文献值［4］的1.30x10-9mol/L非常接近。参考文献RhodesMB,BennettN,FeeneyRE.JBiolChem,1959,234:2054HuJY,S