cd4、cd8、cd20、cd68及mhc-在强直性脊柱炎竖脊肌中的表达

cd4、cd8、cd20、cd68及mhc-在强直性脊柱炎竖脊肌中的表达

强直性脊柱炎（as）是一种以轴关节慢性炎症为主的结构疾病。在中国，发病率为0.3%，致残率为43.4%。大约10%的患者出现严重障碍，严重影响了他们的生活质量。由于AS以骶髂关节炎症为早期表现,长期以来人们仅关注于AS患者骶髂关节及脊柱方面的研究,而忽略了该病椎旁肌的改变。然而,临床医生在检查患者时,常发现早期的AS患者有椎旁肌失去弹性、变硬、僵直等变化。国外学者研究发现:AS的肌纤维中存在轻度单核细胞及脂肪浸润等病理改变,但他们均未涉及该病的肌肉免疫组织化学研究。在国内还未见到对AS患者椎旁肌病理的相关文献报道。为此,本研究通过对AS患者竖脊肌进行常规HE和各种炎性标记物(CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ)的免疫组化染色,来探讨CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ在AS(AS组)患者竖脊肌中的表达情况,以及AS竖脊肌中是否存在炎性改变。1材料和方法1.1性别、年龄及体外诊断选取2010年10月至2011年9月在南方医科大学南方医院、中西医结合医院及广州市正骨医院门诊和住院的不同疾病患者30例。其中AS10例,男8例,女2例,年龄20~28岁;多发性肌炎(PM,PM组)10例,男3例,女7例,年龄42~50岁;腰椎间盘突出症(LIDP,LIDP组)10例,男7例,女3例,年龄51~60岁。前2组均符合AS和PM的诊断标准;LIDP组均以CT、MRI检查诊断为LIDP者,并签署肌肉活检同意书。AS组患者行腰部竖脊肌进行活检,PM组患者行肱二头肌进行活检,LIDP组患者在手术中取腰部竖脊肌进行活检。1.2pcr检测兔抗人多克隆抗体mhc-鼠抗人单克隆抗体CD4、CD8、CD20和CD68均购自北京中杉金桥生物技术有限公司,ABC复合物、DAB浓缩液(浓度为1∶20)为该公司统一试剂盒;兔抗人多克隆抗体MHC-Ⅰ购自上海雅吉生物科技有限公司,浓度为1∶500。冰冻切片机(Germany,LeicaCM1850-1-1型);标本贮存低温冰箱(USAULT1786-4-V41型);摄影显微镜(NIKONPHASECONTRAST,北京中仪光科科技发展有限公司)。1.3抗cd4、cd8、cd20、cd65、mhc-将各组肌肉标本行冰冻切片,每例标本取1张切片行常规HE染色;5张行ABC法免疫组化染色,其处理方法是:冰丙酮固定5min,晾干后经4%H2O2灭活内源性过氧化物酶15min,正常山羊血清封闭30min后弃去血清,分别加入一抗CD4、CD8、CD20、CD68、MHC-Ⅰ,再放入4℃冰箱过夜。PBS液洗涤5min,滴加适量生物素化二抗工作液,常温孵育30min,PBS洗涤5min;滴加ABC复合物30min,最后DAB显色、苏木精复染、封固。以LIDP组作为阴性对照组,以PM组作为阳性对照组。2位病理专家观察所有染色切片,然后用图像分析软件和数据处理软件进行比较。1.4阳性表达强度检测利用摄影显微镜,并固定光线强度,在每张免疫组化切片上随机选取10个观察视野,以10×20倍摄像,出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。CD4、CD8、MHC-Ⅰ阳性表达均位于细胞膜和炎性细胞表面,而CD68阳性表达则位于细胞浆中;阴性表达强度以LIDP组作标准。将每张切片的10个视野图像运用Imagepro-plus6.0图像分析软件处理:分别测量阳性表达区的Area(总面积)、MeanDensity(平均吸光度值),得到IOD值(总面积×平均吸光度值),因IOD指标包含Density信息,故选取IOD值作为监测指标代表阳性表达强度。然后计算每张切片的IOD值,最后综合10张切片IOD结果,得出每种疾病对各抗体的IOD值。1.5cd8方差齐性检验数据运用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量资料用表示,对各组IOD值经正态性检验:除CD8方差齐性,其余均不符合正态性分布。故利用非参数检验-2Independent-SamplesTest,对AS和PM2组中CD4、CD8、CD68和MHC-Ⅰ的IOD值(阳性表达强度)进行比较,以双侧P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.13cd8、mhc-的iiid值与lidp、pm组比较3组中CD20均未见细胞着色(阴性),故对CD20染色不进行比较分析。AS组CD4、CD8、MHC-Ⅰ的IOD值与LIDP组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);AS组CD8、MHC-Ⅰ的IOD与PM组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);PM组CD4、CD68的IOD均明显高于AS组(均P<0.05)。见表1。2.2as对血管周围蛋白表达的影响1)HE染色结果。AS组:AS肌肉中肌细胞大小不等,散在肌纤维内,细胞核增多内移,在炎细胞浸润周围出现局灶肌纤维坏死(封三图1A);PM组:大面积炎细胞浸润,多分布于血管周围,肌细胞严重萎缩且大小不等(封三图1B)。2)免疫组化结果。AS组:CD4、CD8呈弱阳性表达,CD4强于CD8(封三图1C—D)。CD4、CD68在局灶性炎性细胞及肌纤维化组织中有表达,而周围正常肌细胞未见阳性表达(封三图1C、E)。CD68与MHC-Ⅰ呈强阳性表达,MHC-Ⅰ在肌细胞胞浆中出现阳性表达;同时MHC-Ⅰ也在炎性细胞及其周围血管内膜出现阳性表达(封三图1F);PM组:4种标记物均有表达且呈强阳性表达(封三图1G—J),对CD68染色阳性表达敏感较强(莘),见封三图1I。3as肌肉中碳细胞的表达与单核细胞相关性研究AS是一种自身免疫性疾病,以骶髂关节、脊柱及椎间关节炎性改变为主,临床表现为患者腰痛和腰部活动受限。对于早期椎旁肌出现变硬、失去弹性等改变,首先考虑到可能存在局部肌肉坏死的病理改变,R.G.Cooper等研究表明:AS患者椎旁肌存在脂肪浸润,在AS进展期,肌纤维内出现核内移改变。M.Waragai等研究发现:AS患者的肱二头肌存在轻度单核细胞浸润,尤其在肌纤维膜附近的血管周围。同时观察到肌纤维大小不等、散在的再生肌纤维等一系列改变。两位学者的研究结果并不相同,推测可能是由于AS的肌肉在病程的不同阶段存在不同的病理改变所致。但均未见到对肌纤维坏死迹象的报道。本研究旨在对AS的竖脊肌进行各种病理研究,观察AS患者竖脊肌是否存在与国外文献报道相同的病理改变,观察是否出现肌纤维坏死的改变,并探讨哪些炎性细胞在病变中发挥作用。在肌肉炎性病理改变中,PM最为常见,它是横纹肌非化脓性炎性肌病,属于自身免疫性疾病,发病与病毒感染、免疫异常、遗传及肿瘤等因素有关,主要是因为肌肉被淋巴细胞浸润导致,AS和PM在肌肉炎症方面有许多相似之处。J.Zamecnik等研究表明:PM的肌肉标本中CD8+T细胞、CD68+单核细胞都有表达,CD4+有散在的表达,HLA-I在再生的肌细胞胞浆中有表达。同时,HS.Barbasso等对非特异性肌炎病研究发现:MHC-Ⅰ的表达与肌炎中单核细胞浸润有相关性。H.Appel等对AS相关的病理研究显示:在AS活动期,患者椎间关节中CD4、CD8细胞明显高于非活动期,而CD68表达水平则两者相似,故在本研究中利用PM的肌肉作为阳性对照组。由于条件限制,对正常青年人体进行肌肉活检几乎无法实现,尽管LIDP患者年龄均较AS患者年龄偏大,但有研究表明:椎间盘突出症患者的椎旁肌中未出现特征性的病理改变,故可利用LIDP患者的竖脊肌作为该试验的阴性对照组。本研究发现:AS肌肉中肌细胞大小不等,散在的肌纤维内细胞核增多内移(中心核),肌细胞纤维化;同时,在炎细胞浸润周围出现局灶肌纤维坏死——淡染细胞(封三图1A),这些炎细胞浸润区和坏死灶附近的肌细胞膜、炎性细胞表面均对CD4、CD68和MHC-Ⅰ呈阳性表达(荻,与PM组对照,封三图1C、E、F),而其他正常细胞区域未见阳性表达。提示AS的竖脊肌中的确存在局部坏死灶,并且坏死与炎性细胞浸润有密切关系。与LIDP组对比,这些坏死区域的CD8细胞表达呈弱阳性(+,封三图1D);但与PM组相比,AS组CD8细胞的阳性表达强度差别不大。PM组HE染色显示:肌纤维组织间炎性浸润明显,肌束大小不等、部分肌纤维萎缩,结缔组织明显增生(封三图1B),CD4、CD8、CD68、MHC-Ⅰ染色均为阳性,其强度分别为(莘)、(荻)、(莘)、(荻),见封三图1G-J。虽然,AS组与PM组的总体MHC-Ⅰ阳性表达强度无差异(P>0.05),但AS肌肉的MHC-Ⅰ阳性表达位于炎性浸润区周围的肌细胞胞浆内,且呈强阳性(莘,封三图1F),这提示AS的竖脊肌中的炎性细胞与MHC-Ⅰ类有很大相关性。本研究结果证实了以前的观点:AS的肌肉中存在炎性细胞浸润、结缔组织增生等,但同时也观察到肌肉中存在散在的坏死灶。通常CD68和MHC-Ⅰ均在单核-巨噬细胞中表达,本研究结果显示:CD68、MHC-Ⅰ在AS竖脊肌中也呈阳性表达,故推测AS的肌肉炎性浸润可能与单核细胞有关。同时CD68还可表达在破骨细胞表面,这提示AS后期的骨化形成可能也与炎性细胞浸润有关。HLA-B27分子是MHC-Ⅰ类分子,在有核细胞表面均有表达,在免疫系统中主要负责细胞之间相互识别和诱导免疫反应,调节免疫应答的功能。而MHC-Ⅰ和CD4+Th1细胞在Ⅳ型超敏反应中起到重要作用,同时少量的CD8+CTL也辅助参与,这与本研究的结果相吻合。提示:在急性期的AS中,竖脊肌可能存在Ⅳ型超敏反应。综合上述,AS与PM的肌肉炎性浸润两者不同,在PM中主要以淋巴细胞浸润为主,