土壤解磷微生物的研究进展

土壤解磷微生物的研究进展

磷酸是植物营养的三个重要因素之一。一般来说，农业用地中的磷素含量是丰富的。然而据估计,我国2/3的耕地土壤缺磷,原因是这些磷素大多以不易被植物吸收利用的难溶性有机和无机态磷形式存在。为了获得高产,反复施用的大量磷素化肥又很快被土壤固定成难溶性磷化合物,这不仅造成环境污染,还会给食物安全和人类健康带来影响。土壤解磷微生物可以提高植物对磷的利用效率,改善植物营养条件,提高作物产量,增加抗病能力;而且还可以改善土壤结构,提高有机质含量,改良盐碱地,对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要的作用。虽然有关解磷微生物的研究和应用已有多年,但解磷微生物肥料的发展速度不快,应用还不普遍。其原因主要是解磷微生物种类多,解磷机理不十分明确,解磷作用发挥的条件等都不十分了解,因而它的生产应用受到很大限制。为此,笔者对国内外有关解磷微生物(尤其是解磷细菌和真菌)解磷机制的研究动态和解磷微生物对作物生长发育的影响方面的研究进展进行了综述。1植物根际的生物多样性具有解磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌等。目前,已报道的大约有二十几个属。土壤中解磷微生物的种群生态分布表现出强烈的根际效应,即种类、数量、分布和菌种与根际环境间相互关系等均受根际微域环境(土壤物理结构、有机物质含量、土壤类型、土壤肥力等)的影响。在植物根际,解磷微生物的数量要远远大于其周围土壤中的数量。Kabznelsonetal等发现,玉米、红三叶草、亚麻、燕麦、大麦、黄桦树苗根际解磷细菌约有106~108cfu/g,比非根际土壤高1~2个数量级,其中,亚麻的根际解磷细菌数量最多。同时发现,大麦对解磷细菌表现出选择性,其他植物则没有明显的选择效应,黄桦树苗还出现抑制作用的现象。赵小蓉等也发现,解磷菌的分布表现出强烈的根际效应,即根际土壤的数量比土体要多,但并不是根际微生物的优势菌株。赵小蓉等另一研究表明,玉米、冬小麦根际土壤解磷菌数量要比非根际高1~2个数量级,因此认为,根际微生物数量可能主要受根系分泌物数量的控制,而根际微生物群落结构则可能主要受根系分泌物类型的影响。2细菌的溶磷能力不同微生物的解磷能力差异较大。尹瑞龄从土壤中分离出了265株具有分解摩洛哥磷矿粉能力的细菌,它们的溶磷能力平均为2~30mg/g,其中44株巨大芽孢杆菌、节杆菌、黄杆菌、欧文氏菌及假单胞菌的解磷能力较强为25~30mg/g。Sundara等利用Ca3(PO4)2作为磷源,发现几株芽孢杆菌释放的可溶性磷为56.80~70.52μg/ml,埃希氏菌属释放的可溶性磷为159.70~170.30μg/ml。与溶磷细菌的溶磷能力相比,虽然溶磷真菌在数量和种类上都少于溶磷细菌,但溶磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌。Kucey报道,真菌的解磷能力一般是细菌的10倍,许多细菌在进一步的纯化中失去解磷能力,而真菌则始终保持其解磷活力。后来林启美等、Zayeac等也发现,溶解磷矿粉能力较强的细菌溶磷能力为26.92~43.34μg/ml,而大多数真菌则为59.64~145.36μg/ml;且溶磷细菌数量多时,才能起到溶磷作用。目前,研究报道的溶磷真菌多为曲霉属和青霉属。Cerezine等报道黑曲霉在液体培养过程中随着菌丝体的生长,对不溶性磷酸盐的溶解能力逐渐增加。Vassilev等也研究了黑曲霉对矿物磷酸盐的溶解,其溶解能力最高达292ng/ml。范丙全等筛选得到2株具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1,并在不同培养条件下测定了它们的溶磷能力。与拜莱青霉菌ATCC20851和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14581比较,草酸青霉菌P8和Pn1在固体培养基上表现出较强的溶解Ca3(PO4)2、Ca3[H2(PO4)]6·5H2O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力;在盆栽条件下,接种青霉菌P8菌剂的土壤能提高作物的吸磷量,其生物产量比不接种显著提高,且在有效磷低的土壤上其增产幅度大于有效磷高的土壤。3土壤微生物解磷机制的研究3.1葡糖酸和pq基因的共源性分离Liu等研究发现,一些溶磷能力较好的革兰氏阴性菌在壁膜空间中存在着直接氧化途径。溶磷细菌通过直接氧化途径向胞外环境释放强酸,从而酸化难溶性钙磷化合物中的磷,参与这个途径的酶都定位于细胞膜外侧。该氧化途径的第一步是葡萄糖在葡萄糖脱氢酶(GDH)的作用下被氧化成葡糖酸。GDH是醌蛋白家族中的一员,它所催化的酶促反应需要氧化还原辅助因子2,7,9!三羧基1H!吡咯!喹啉!4,5!二酮(PQQ)的参与。PQQ是维生素B族的成员之一,它还具有保护细菌抗辐射的能力。葡糖酸进一步被氧化形成酸性极强的葡糖酮酸,然后被分泌到细胞壁和细胞膜之间,使胞外环境酸度极高。因此,在这个途径中,GDH和PQQ的共同作用是关键的。最近,Goldstein利用功能互补法在大肠杆菌基因文库中寻找pqq或gdh基因时发现,一些与pqq基因没有同源性的DNA片段也能诱导PQQ合成。因此推测,在解磷细菌体内可能存在另一个新的醌蛋白葡萄糖脱氢酶反应途径。3.2磷矿粉的代谢产物目前,解磷菌对难溶无机磷酸盐的解磷机制一般都被认为是由于菌体生长过程中产生各种有机酸,而将其中的磷溶解释放出来,即“酸解作用”。曲霉、青霉、欧文氏杆菌和肠杆菌等之所以具有溶解磷矿粉能力,主要是由于分泌有机酸,直接溶解了磷矿粉,其中肠杆菌和欧文氏菌分泌的有机酸物质还起着螯合和络合作用。不同微生物分泌有机酸的数量和种类差别很大,真菌分泌的有机酸种类比细菌要多,林启美等用HPLC手段检测到这些有机酸的成分和含量差别。这些酸既能降低pH值,又可与铁、铝、钙等离子结合,从而使难溶性磷酸盐溶解,其作用大小不仅取决于分泌酸的种类和数量,更与其机制的缓冲性及能与磷酸根离子螯合的离子多少有关。钟传青测定发现,巨大芽孢杆菌在以黄麦岭磷矿粉、黄金卡黄磷矿粉为唯一磷源时的发酵液能产生柠檬酸、琥珀酸、乳酸及乙酸等有机酸,可能通过螯合磷矿粉中的金属离子,使磷游离出来。3.3磷系统治磷原理微生物(尤其是真菌)对有机物的矿化作用主要是微生物在代谢过程中产生各种酶类,即通过分泌植酸酶、核酸酶、脱氢酶和磷酸酶等物质使有机磷酸盐矿化,成为植物可以吸收利用的可溶性磷。酶解作用是有机磷降解的重要途径。当有效磷低于一定值时,微生物和植物感受到低磷胁迫,就会分泌胞外酸性或碱性植酸酶、脱氢酶和磷酸酶等物质,将磷酸脂等有机磷降解,释放出有效磷,而此时,微生物对磷的代谢作用明显多于植物,并且使植物生物量、根长、产量等显著提高。微生物矿化作用易受环境因素的影响,适中的碱性环境更有利于其发挥作用。3.4降低细菌磷源及对磷的解磷能力目前,科学家对溶磷酸基因及相关调控序列的研究已越来越多。编码PQQ和GDH蛋白的基因已经被克隆和表达,溶磷细菌中缺少pqq或gdh基因,都不能表现出解磷功能。Goldstein等开展了一些大肠杆菌和草生欧文氏杆菌的有关解磷功能调节的研究,发现细菌的解磷能力直接受培养基中可溶态磷酸盐水平的调节,且细菌溶解矿物磷酸盐的功能可随培养基中临界磷浓度的增加或减少而被开启或关闭。此外,Goldstein等在试验中采用2种不同基因型的细菌HB101和草生欧文氏杆菌,进行了解磷基因克隆的尝试,发现前者不能在以HAP作为唯一磷源的限制性培养基上生长,而后者则对2种形态的磷都能利用。根据这种表现型上的差异,他们将欧文氏杆菌中1段含HAP溶解功能的DNA片断克隆到HB101内,使之能够在以HAP为唯一磷源的培养基上生长,并发挥溶磷功能。这些研究结果说明,在分子水平上对解磷微生物进行研究,可以分离和克隆相关的解磷基因,以进一步提高微生物的解磷能力,从而改善土壤中速效磷的含量。4土壤中的磷有机肥料对作物生长的影响4.1对微生物的作用植物对磷的吸收与根系长度、根毛数量、根系代谢活性等诸多因素有关。郜春花等报道,用解磷菌剂处理的青菜根系较发达,主根长和根系鲜重较不接种对照分别增加了29.8%~16.3%和58.3%~62.5%。根系的增大,促使根系分泌物增多,导致根系吸收养分能力也相应增强,从而促进作物地上部分生长,鲜重、干重和生物量分别较对照增加41.1%~23.5%,24.9%~15.8%和41.6%~24.6%。Rovira等提出了微生物可能影响根际作用的4个方面:①影响根细胞的渗透性;②影响根的代谢活动;③对某些分泌化合物有吸收作用;④改变根际营养成分。如多黏杆菌产生的多糖素能够增强植物根部细胞透性,从而导致根系分泌较多的氨基酸。某些细菌及真菌等还能增加燕麦根部分泌7%羟%6甲氧香豆素的能力。小麦根际解磷细菌Pseudomonasputida可转化小麦根系分泌物中的糖等碳水化合物,刺激根系分泌物的分泌。Arihara等研究表明,菌根真菌可以通过真菌菌丝体的生长,增加植物根系吸收磷的面积,扩大根圈范围,促进根际酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的提高,从而改变植物的生长状态。这种接种处理一般发生在植物发育早期,才能够明显促进根的生长,后期这种作用几乎消失。4.2解磷微生物的用量接种解磷菌在植物生长前期对叶重有很大的影响。接种解磷菌的叶片要比施加肥料的叶片大,表现为叶片迅速向四周生长并且更快达到最大生长点。这样使植物在前期生长迅速,提高植物防御病虫害的能力,因为这个时期是植物对环境压力最敏感、最易造成作物减产及质量降低的时期。因此,解磷菌在植物(尤其作物)生长早期施用无疑具有重要意义。解磷微生物(细菌、真菌等)通过代谢作用溶解根际难溶性磷化物,补充植物所需磷矿营养的同时,还有利于植物对N、K、Ca、Mg、Fe、Zn等其他营养元素的吸收,促进植物地上部分的生长,提高生物量和产量。如在小麦和珍珠稷根部接种真菌Chaetomiumglobosum,提高了磷酸酶和植酸酶的分泌量,转化土壤中的植酸磷,从而使生物量和产量增加23%~32%。郝晶等曾研究不同解磷菌群对豌豆生长和产量的影响,结果表明,使用解磷菌剂能大幅度提高豌豆产量,产量多少与接种的菌群关系为:真菌>细菌>混合菌,再一次确认了真菌的解磷能力高于细菌。4.3促进作物病害的作用在作物根部使用微生物肥料,微生物在作物根部大量生长繁殖,作为作物根际的优势菌,限制了其他病原微生物的繁殖机会。同时,有的微生物对病原菌还具有拮抗作用,或者分泌抗菌素,抑制或杀死致病真菌和细菌,起到了减轻作物病害的功效。接种解磷微生物不仅刺激植物快速生长,还可减少根系有机酸、磷酸酶等物质的分泌,在很大程度上减轻了植物由于营养缺乏而导致的根际酸化现象。曾广勤等研究表明,解磷菌还可以提高小麦的氮磷含量,充足的氮磷营养使小麦根系碳同化作用更旺盛,碳水化合物积累更多,从而改善产品质量,并提高小麦的抗旱抗寒能力。5生物-环境关系(1)继续筛选高效解磷菌,把重点放在从特定作物的根面、根际土壤中筛选,进而提高土壤中可溶性磷的含量。