腐植酸的提取及其生理作用

腐植酸的提取及其生理作用

腐植酸（ha）是指植物和一般植物的遗迹，通过微生物的分解和转化，以及由各种化学过程形成的有机物质（郑平，1991）。1919年,Oden提出将腐植酸分为水溶性的黄腐酸、乙醇可溶的棕腐酸和碱溶性的黑腐酸。腐植酸的分级流程为:腐植酸表现为酸性,所以易溶于碱性溶液。Fujitake等(1998)在从土壤中提取黄腐酸(fulvicacid,FA)和胡敏酸时发现,在pH3～7之间,FA产量随pH升高而降低,在pH9～13之间,FA产量随pH升高而增加。而胡敏酸产量受提取液酸碱性影响不大。从进化程度低的有机物(污泥和灰泥)得到的腐植酸具有较高的脂肪族特征,含氮化合物含量高,氧化程度低,成分不均一(Aguso等,1997)。分子量比较低的为黄腐酸(300～400),分子量中等的为棕腐酸(2×103～104),分子量较高的为黑腐酸(104～106)。也有人将腐植酸分为低分子量组分(<5KDa)和高分子量组分(>5KDa)(Varanini等,1993)。一般认为低分子量组分具有较高的生物活性。因为腐植酸是不均一的,所以没有明确的结构,较公认的观点是在芳香族或脂肪族的中心上连接着酚基和竣基(Masini等,1998),多肽和碳水化合物(Concheri等,1996),以及螯和的金属离子。人们对腐植酸的研究是多方面的:如用化学分析及光谱技术对腐植酸进行定性分析(Ayuso等,1997),在酸性土壤中腐植酸与A13+的相互作用(DaSilva等,1997),以及在水体净化、医疗等方面的应用(郑平,1991)。本文着重于评述腐植酸对植物生理活动加植物的生长、营养元素吸收、光合、呼吸及酶活性等方面的影响。1腐植酸促进植物生长许多文献报道,腐植酸在一定条件下可以刺激生长,这也是腐植酸的主要生理作用。研究材料很广泛,本文只涉及高等植物及高等植物的器官。1.1腐植酸对作物的作用早在19世纪,人们就从营养角度认识到土壤中的腐植酸对植物生长的重要性。后来也有许多文章报道,适宜浓度下,腐植酸对植物生长有促进作用(David等,1994;Dekock,1955)。Malik等(1985)发现水墙介质中加入少量的胡敏酸(54mg·L-1)可使玉米根长增加500%,根的干重、鲜重也明显增加。Fagbenro等(1993)用抽木幼苗进行实验,结果表明胡敏酸对抽木幼苗的月生长率、高度、总干物质产量都有显著促进作用。此外,小麦、番茄。棉花幼苗生长,特别是根的生长受到腐植酸钠的显著促进(梅慧生等,1980),黄腐酸对黄瓜幼苗的生长、每株叶片数、成花数都有明显促进作用(Rauthan等,1981)。许旭旦等(1983,1986)在盆栽或田间生长的小麦幼苗上喷施黄腐酸,能使产量增加7.3～18.0%,也能使干旱情况下不减产,达到正常浇水产量的97%。腐植酸对生长的促进作用已经从大量实验得到证实。但是,由于植物种类不同,年龄不同,培养条件不同,报道的数值有很大变化。Sladky(1959)报道黄腐酸使番茄的根长增加10%,鲜重和干重分别增加245%和390%。Adani等(1998)报道腐植酸使番茄根的鲜重和干重分别增加16%和18%。相同的腐植酸,相同的处理对红槭树的生长无影响,却使华盛顿山植的树冠干重、根长都高于对照(Kelting等,1998)。完整植物不同器官对腐植酸的反应存在差异,一般情况下,腐植酸对根的刺激作用大于茎叶(梅慧生等,1980)。在有些情况下,对有的植物(如番茄),只对根的生长有刺激作用,对地上部无效(Adani等,1998)。根据作物对腐植酸刺激反应的敏感程度,把作物分成几种类型:反应最敏感的作物——白菜、萝卜、番茄、马铃薯、甜菜、甘薯;反应比较敏感的作物——玉米、水稻、小麦、谷子、高粱、莜麦;反应中等的作物——棉花、绿豆、菜豆;反应不敏感的作物——油菜、向日葵、蓖麻、亚麻等(郑平,1991)。培养条件对实验结果的影响是不可忽略的。首先有的实验在田间进行(Xu,1986),土壤中的因素很复杂,与实验室较明确的条件比,更难以重复,优点是应用价值高。即使是在实验室,用营养液进行实验,也有很多影响因素。首先,营养液的组成很重要,供植物整体生长的营养液就有Sachs、Knop、Hampe、Hoagland等,不同营养液中各种成分的比例不同,对植物的生长产生的影响是不同的;其次,营养液各成分的相互作用可以导致沉淀的产生,从而降低某些元素的有效浓度并导致这些元素的缺乏症;第三,根的溢泌物常常会降低介质的pH值,这不仅会使营养液中沉淀增加,腐植酸也会随pH的降低而沉淀出来(Vaughan等,1985)。而且在pH较低的情况下,腐植酸甚至会降低某些元素(Fe、Mn、Zn、Cu)的吸收,使地上部鲜重减少(DaKreij等,1995)。第四,很多实验并不是在无菌条件下进行的,因此,腐植酸还有被微生物降解的可能(Ziegenhagen等,1998;Benz等,1998)。所以,要经常更换营养液。植物生长在不同营养条件下,腐植酸对生长的影响是不同的。Malik等(1985)发现在无氮培养基中,54mg·L-1的腐植酸能引起根部明显增加,而在有氮存在的条件下,根和地上部的生长受阻。Lee等(1976)认为腐植酸在有机质含量低的土壤中对生长的刺激作用最大。如果将匍匐剪股颖培养在沙地中,叶面喷施腐植酸,或将腐植酸掺入到10cm深的土壤中,都会刺激根的生长;如果培养在营养较适宜的溶液中,腐植酸对其生长影响不大(Cooper等,1998)。因此,研究者在实验过程中应该注意植物所处环境的营养状况。尽管进化程度不同的腐植酸对生长都有刺激作用,但效果是不同的。如从泥炭得到的腐植酸只对番茄根的生长有刺激作用,对地上部无效;而从褐煤得到的腐植酸则对根和地上部的生长都有促进效应(Adani等,1998)。Concheri等(1996)发现土壤上层为低分子量的腐植酸成分,在影响与生长代谢有关的酶(转化酶和过氧化物酶)活性上更重要。腐植酸的不同组分对生长的刺激效应也不同。叶面喷施低分子量的黄腐酸和中分子量的棕腐酸对改善哈密瓜的品质有明显效果,而高分子量的黑腐酸叶面喷施无效,可能是因为它不易进入植物体(刘增祥,1985)。对藻类的生长,黄腐酸比胡敏酸的效果明显,而最大的刺激效应是,黄腐酸和胡敏酸的混合物引起的(Lee等,1976)。另一个重要问题是腐植酸的使用浓度。与生长素类似,腐植酸也表现为低浓度促进,高浓度抑制(Fagbenro等,1993)。刘增祥(1985)认为在作物生长初期或浸种以100mg·L-1腐植酸为宜,在作物生长后期,可以在100～500mg·L-1范围内变动。对黄瓜幼苗生长和每株叶片数和成花数,100～300mg·L-1的黄腐酸促进效果明显(Rauthan等,1981)。Malik等(1985)发现54mg·L-1的腐植酸对小麦幼苗的生长促进效果最好,而Lee等(1976)证明对玉米幼苗最适的腐植酸钠浓度为5mg·L-1C。国内实验大田的腐植酸使用浓度一般为100～500mg·L-1(刘增祥,1985;许旭旦等,1983),实验室内的使用浓度较低,为50～300mg·L-1(梅慧生等,1980)。腐植酸的效应与使用后的时间有关,Vaughan等(1985)在萌发前用50mg·L-1腐植酸浸种,对小麦幼苗的生长有促进效应,但10天后这种效应消失。梅慧生等(1980)用浸根的方法也发现腐植酸钠的生长刺激作用不仅要求一定的浓度,也有一定的时间效应,到第10天增长的百分比已经很低,所以,需要持续供应腐植酸钠。1.2胡敏酸对鱼的生理作用腐植酸对生长的作用有生长素的类似效应。许多研究者利用离体器官,用生长素的生物鉴定法或其它生理作用,以腐植酸代替生长素进行实验(O’Donnell,1973;Vaughan,1974)。反过来,也可以利用这种方法来确定腐植酸生物活性的大小。因为用于生长素生物鉴定的离体器官比较幼嫩,如番茄根、豌豆根和小麦胚芽鞘等,它们的最适浓度比完整植物的相对低一些(Linehan,1976)。腐植酸的不同组分对番茄根的作用不同。胡敏酸在促进生长上显得更有效。精细研究表明,胡敏酸对细胞伸长的促进作用比对细胞分裂的促进作用更大,而黄腐酸在细胞分裂方面的效果则更明显一些(Vaughan等,1985)。50mg·L-1胡敏酸只促进豌豆离体根切段的细胞伸长,而细胞数目并不增加(Vaughan,1974)。O’Donnell(1973)发现胡敏酸和黄腐酸既能促进天竺葵根切段伸长,也能使根的数目增加,与Linehan(1976)用番茄根和Schnitzer(1967)用蚕豆下胚轴的实验结果一致。Goenadi等(1995)发现买麻藤根的发生可以明显被腐植酸诱导,地上部的发生阶段可因腐植酸的存在而明显缩短。Kelting等(1998)也发现,腐植酸盐能使移植后的红槭树吸水增加,从而使植物体内汁液流动增加。此外,腐植酸还能使水稻愈伤组织鲜重及细胞数目增加(Wang等,1999)。以上实验都证明腐植酸具有生长素活性。腐植酸能促进种子萌发(Ayuso等,1996a),在这方面有类似GA的活性。胡敏酸能使不照光的喜光种子和照光的厌光种子萌发,对正常照光的种子萌发无作用,说明这一过程与光敏色素的调节有关(Vaughan等,1985)。在促进萝卜子叶扩张方面,腐植酸钠有细胞分裂素的活性(梅慧生等,1980),在抑制气孔开启和促进超氧物歧化酶活性上,腐植酸有脱落酸的活性(梅慧生等,1983;Vaughan等,1982;Vaughan等,1983)。1.3腐植酸对燕麦幼苗根生长和代谢的影响关于腐植酸促进豌豆根细胞伸长的机制,Vaughan(1974)认为胡敏酸能抑制细胞壁结合的脯氨酸向羟脯氨酸的转化。这一过程需要Fe2+参与,细胞壁结合的羟脯氨酸增加会导致细胞停止伸长。胡敏酸可能通过螯合Fe2+以减少脯氨酸的转化,从而促进生长。Young等(1997)用HPLC检测了从土壤及不同来源的腐植酸提取到的多胺(腐胺、亚精胺、精胺)的含量大约为0.4～7.0nM/g。而纯化多胺刺激莴苣根生长的最适浓度为10-6～10-12M。这就为腐植酸的类生长素活性提供了另一种解释。10mugC/ml腐植酸与燕麦幼苗根温育3～4小时后,可刺激由根引起的外部介质的酸化,而在溶液中加入0.5mM钒酸盐,强烈地抑制质子外渗。说明腐植酸刺激燕麦幼苗根H+外泌的过程有H+-ATPase的参与,这与生长素诱导植物酸生长的机理不谋而合(Pinton等,1997)。植物细胞表面有氧化还原反应,这些反应的进行与细胞内释放的物质有关。腐植酸可部分抑制NADH氧化酶的活性,其原因是腐植酸影响了细胞壁内的代谢过程,这可能是腐植酸促进植物生长的另一原因(Pinton等,1995)。腐植酸能促进植物生长,还与腐植酸能促进营养吸收以及腐植酸的降解产物能掺入到植物的蛋白质和DNA中有关,这将在后面专门讨论。总之,因为腐植酸成分复杂,功能多,它促进植物生长可能是影响了植物多方面的生理活动。1.4腐植酸通过降低有毒物质的毒害促进植物生长有些物质对植物有害,腐植酸促进植物生长可能与它能够降低这些物质的毒害有关。马来酰肼(MH)是一种除草剂,它的结构与尿嘧啶非常相似,进入植物体内可以代替尿嘧啶的位置,阻碍正常代谢,抑制生长。植物吸收的胡敏酸和黄腐酸能起到抗诱变剂的作用,从而使植物正常生长(DeMarco等,1995)。0.1～1.0mg/L亚硒酸盐对种子萌发。胚胎发育、生长都有刺激作用,但当其浓度超过1.0mg/L时,表现为毒害。黄腐酸的存在能减少Se的毒害,原因可能是黄腐酸使植物对Se的吸收减少,从而促进了生长(Wang等,1996)。酸性土壤中Al3+的毒害较强,而Al3+和有机配体的结合能降低毒害,黄腐酸和腐植酸能强烈地化合Al3+,在有Al3+或无Al3+的情况下都能刺激玉米根伸长(Harper等,1995)。因此,在有害环境中,腐植酸能帮助植物抵抗毒物或减少毒物的吸收,从而促进植物生长。2腐植酸提高根的合能力很多关于腐植酸的研究都涉及到它对营养元素吸收的影响(Fagbenro等,1993;Rauthan等,1981)。叶面喷施黄腐酸能促进P向籽粒的转运,随后有机物向籽粒的转运速率加快(Xu,1986)。土壤中施用腐植酸也能促进根对无机P的吸收(Lee等,1976;Vaughan等,1978)。整体植物的实验表明,在土壤或营养液中加入胡敏酸或黄腐酸能促进N、P、K、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe的吸收(Rauthan等,1981),P的吸收能增加72%,N的吸收能增加74%(Ayuso等,1996b)。Liu等(1998)发现腐植酸促进匍匐剪股颖组织Mg、Mn、S含量,降低Ca、Cu、N含量,对P、K、Fe、Mo、Zn含量无影响。腐植酸促进营养的吸收与外界条件有关。匍匐剪股颖培养在较贫瘠的沙地时,腐植酸处理使P3+的吸收比对照增加3～5%,如果培养在营养适宜的溶液中,P3+的吸收不受影响(Cooper等,1998)。如果外界环境州较低,腐植酸对柑橘等K、Ca、Mg吸收无影响,使Fe、Mn、Zn、Cu吸收下降(DeKreij等,1995)。因此,这是研究者应该注意的问题。腐植酸能促进根的生长及侧根的形成,增大了根的有效吸收面积(李绪行等,1991;Vaughan,1974),也能促进根系活力(许旭旦等,1983;Xu、1986),从而提高了根的吸收能力。另一方面,腐植酸具有螫合能力,能使Fe、P等变得更容易被植物吸收,在一定程度上代替EDTA的作用(Vaughan等,1985)。腐植酸铁是饮用水脱色过程中的副产品,而缺Fe引起的缺绿症是生长在碱性土壤中柑桔的典型病症。在春天对这些植物冠层每树每年施用22g腐植酸铁能使柑桔枝条生长更好,着色率增加,叶片Fe含量增加,而且会使施用一年后果实产量增加(Alva等,1998)。肥料中的黄腐酸铁与无机铁相比,不仅使水稻幼苗Fe含量增加,也使水稻幼苗吸收的离子总量增加(Pandeya等,1998)。可见,腐植酸铁有较高的应用价值。Adani等(1998)认为腐植酸使Fe3+变为Fe2+,可能是Fe可利用性增加的原因。从细胞水平上看,许多研究者已经注意到胡敏酸对膜的透性及膜上的离子载体的影响(Pinton等,1992;Samson等,1989;Varanini等,1993),腐植酸和表面活性剂有相似的生理功能(Malcom等,1979),作为类表面活性剂,腐植酸生理功能的最初靶子之一是细胞膜,它能够改变膜脂质的相变特征,从而改变了膜的流动性,增加了膜的渗透性(Samson等,1989)。细胞膜上有离子载体蛋白,这些载体蛋白即离子吸收能力也受到胡敏酸的影响。对于水漂洗的甜菜根薄片,胡敏酸能刺激Na+、Ba2+、PO43-等离子的吸收能力,抑制Cl-的吸收能力,对Ca2+吸收能力无影响,说明胡敏酸只影响蛋白质合成的某些方面(Vaughan等,1971;Vaughan等,1976)。Varanini(1993)和Nardi(1991)发现低分子量腐植酸(<5KDa)或水溶的腐植酸通过刺激K+-ATPase的活性来刺激NO3-的运输,同时H+的跨膜透过也受到刺激。Pinion等(1992)证明如果将短杆菌肽D加到实验介质中,K+-ATPase的活性不再受低分子量胡敏酸的影响,说明腐植酸对酶蛋白有直接刺激作用。高分子量的腐植酸作用相反(Varanini等,1993)。而且低分子量腐植酸只有在鉴定介质中有K+存在时才对ATPase水解部分的活性起作用,K+能刺激质膜ATPase活性(Brinski,1987;Pinion等,1997),说明腐植酸在一定程度上提高K+和酶之间的作用效率,从而使磷酸水解活性增强(Varanini等,1993)。低分子量腐植酸对膜透性及ATPase活性的影响已基本得到肯定,与Serrano(1989)提出的低分子量腐植酸能影响与细胞生长和代谢有关的膜的活性是一致的。腐植酸能刺激植物生长,并有植物激素的效应,而植物生长和激素的作用机理都包括膜系统的重要活性,这也可能是腐植酸分子最初的作用模式。腐植酸不仅能影响细胞膜,还能进入细胞质,对细胞器起作用。Vaughan等(1981)发现14C-标记的土壤有机物(含腐植酸)在无菌条件下可被豌豆根吸收,培养18小时后,组织对黄腐酸或沸水可溶组分的吸收多于对胡敏酸的吸收。任何分子量的土壤腐植酸都能吸附到细胞壁上,低分子量组分的吸收更加依赖代谢,即大多数标记的腐植酸能不可逆地结合到向日葵根表面,只有较小的分子能从根转移到地上部参与代谢,这能合理地解释细胞壁上的转化酶比上清液的转化酶受到更强的刺激。Vaughan等(1976)发现15%14C一标记的胡敏酸能进入薄壁细胞,并连接到线粒体部分,可见胡敏酸能进入细胞内影响代谢过程。在实际情况下,根的渗出液能调节进入细胞的腐植酸分子的大小,细胞壁是腐植酸的生物分子滤器,通过这种方式,植物可以调节、限制细胞膜上和细胞质内的腐植酸的浓度,防止浓度过高引起负效应(Albuzio等,1989)。3小麦超氧化物歧化酶和过氧化氢酶Wang等(1999)用14C一标记的腐植酸进行实验,结果表明水稻细胞能利用腐植酸的降解物来合成蛋白质和DNA。关于腐植酸对蛋白质合成影响的研究是从腐植酸影响酶的合成开始的。腐植酸能影响许多高等植物酶的合成,如番茄的过氧化氢酶、多酚氧化酶和细胞色素氧化酶,甜菜根的转化酶和过氧化物酶等(Vaughan等,1985;Concheri等,1996),小麦叶片的超氧物歧化酶和过氧化氢酶(陈玉玲等,1997)。要使酶合成的刺激作用最强,培养介质中必须持续供应腐植酸。使用蛋白质合成抑制剂和RNA合成抑制剂都能抵消这种效果。腐植酸对核酸含量也有影响。腐植酸能使小麦、玉米和洋葱分生组织间期细胞核体积增大,原因是DNA含量增加。3H-标记的胸苷实验证明DNA合成增加,3H一标记的尿苷实验证明相应的mRNA增加。胡敏酸也能加快蚕豆和向日葵细胞RNA合成率和32P掺入到核苷酸的速率。DNA的消长与生长的变化是一致的,Fialova(1969a,1969b)观察到小麦生长在水中时,根中RNA含量在萌发后两天达最高(25μg/株),然后很快降低,胡敏酸存在时,RNA含量在萌发后5～7天达最高(33μg/株)。但是当小麦培养在完全营养液中时,ANA含量在萌发后7～9天达最高(60μg/株),然后更加缓慢地下降。RNA含量的变化与细胞伸长一致,而放线菌素D能抵消腐植酸引起的细胞伸长。腐植酸对RNA合成的影响是不均衡的,核糖体RNA受影响最大。4腐植酸对果酒酶活性的影响叶面喷施或在营养液中施用腐植酸,会引起叶绿素含量增加(郑平,1991;Xu,1986),甚至在阳离子缺乏的条件下防止黄化,可能是因为腐植酸促进了Mg2+或Fe2+的吸收,从而使叶绿素含量增加(DeKock,1955)。叶绿素含量增加会导致光合作用加强,并会使干物质积累增加。但Liu等(1998)证明腐植酸明显促进匍匐剪股颖净光合作用,而对叶绿素含量无影响。关于腐植酸影响光合器官——叶绿体的研究还比较欠缺。腐植酸对呼吸作用的影响研究得比较多。对呼吸作用,黄腐酸比胡敏酸的促进作用更大(Vaughan等,1985)。腐植酸能直接参与呼吸作用,在O2浓度正常的情况下,腐植酸进入植物体内并作为H受体而起作用。