大二上学期生物化学4酶

第四章酶学Enzyme

学习纲要酶促反应特点及酶的分类酶的结构与功能的关系酶的作用机制酶促反应动力学酶的活力测定学习提要本章着重介绍酶的化学本质、结构、特性和功能、酶反应动力学，对调节酶、同工酶、多酶体系、诱导酶和固相酶等术语的含义和重要性也作了必要的介绍。在学习本章时应注意：1.首先认识酶的本质是蛋白质，同一般蛋白质有共同之处，也有不同之处。从结构上与一般蛋白质的共同点去理解酶的理化性质；从不同点去理解酶的特异性、催化作用和催化机理。2.结合酶的化学本质和催化机制学习各种影响酶反应速度的因素。酶学研究简史(自学)公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母菌细胞生命活动的结果。1879年,Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。(1911,诺贝尔奖)1926年，sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶证明酶的化学本质是蛋白质。（1949,诺贝尔奖）核酶(ribozyme)

1981～1982年，ThomasR.Cech实验发现有催化活性的天然RNA—Ribozyme。（1989,诺贝尔奖）

L19RNA和核糖核酸酶P中的RNA组分具有酶活性。

50S亚基中的23SrRNA具有肽酰基转移酶的活性．

1995年，发现DNA的催化活性。抗体酶（abzyme）：

1986年，RichardLerrur和PeterSchaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalyticantibody）。酶的概念：

目前将生物催化剂分为为两类：

蛋白酶、核酶酶是一类由活细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。第一节酶促反应特点及酶的分类（自学）一、酶促反应的特点（一）酶与一般催化剂的共同点在反应前前后没有质和量的变化；只能催人热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变平衡点。（二）酶催化作用特性酶的催化作用可使反应速度提高106-1013倍。例如：过氧化氢酶催化H2O2的分解1．高效性用

-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。用Fe+

催化，效率为10-5

mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为105mol/mol.S。2H2O22H2O+O2酶的专一性又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物具有选择性2．高度选择性酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40

C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。3．反应条件温和（对外界环境高度敏感性）4.酶活力可调节控制（可调性）如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。

酶的催化特性归纳：三“高”一“调”（或四“性”）二、酶专一性的类别酶作用专一性反应专一性立体异构专一性相对专一性绝对专一性键专一性基团专一性光学专一性几何专一性定义：酶对所作用的底物具有的选择性类型：相对专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。例如：RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH（键专一性）（基团专一性）绝对专一性：酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。光学专一性（对有旋光性物质）一种酶只能作用于几何异构体或生成几何异构体中的一种，例：延胡索酸酶，只能催化反—丁稀二酸水化生成苹果酸当S具有旋光异构体时，酶只作用于其中的一种，例：氨基酸氧化酶，只作用于L—氨基酸几何专一性（对顺反异构体）CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2O三.酶的命名1.习惯命名法:

（1）根据其催化底物来命名；（2）根据所催化反应的性质来命名；（3）结合上述两个原则来命名；（4）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。2.国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质,2个底物，底物之间“：”，水解酶水解2字可省略，最后加一个酶字。例如：习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:L-丙氨酸：

-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:

谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸一些酶的命名举例四、酶的分类1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1.氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶（2）氧化酶类①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O22.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。A·X+BA+B·X根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH羧酸脂酶催化脂的水解反应4、裂解酶类：催化非水解性地除去基团或形成双键反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。CH3C=OCOOHC—C键CH3C=OH+CO2C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35、异构酶：催化各种异构体之间的互变。常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。

PP合成酶催化C-C、C-O、C-N以及C-S键等的形成反应。这类反应通常与ATP分解反应相互偶联(需能反应)。

A+B+ATP+H-O-H===A

B+ADP+Pi主要包括连接酶(Ligase),合成酶,羧化酶等例如，丙酮酸羧化酶催化的反应丙酮酸+CO2

草酰乙酸6.合成酶SynthetaseCOOHC=OCH3CO2+COOHC=OCH2COOH乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号五、酶的系统编号第二节酶的结构与功能的关系一.酶的化学本质

大多数酶是蛋白质1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。酶是蛋白质的证据：从化学组成和理化性质看。1982年T.Cech发现了第一个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。辅基(prostheticgroup)酶单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。双成份酶酶蛋白辅因子（简单蛋白质）（结合蛋白质）（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子二.酶的组成1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，属于单纯酶，全部参与水解反应。2.寡聚酶

(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，如ATP酶有10个亚基。单个亚基没有催化活性，亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物

(multienzymesystem)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应，可提高酶促反应的速度。例丙酮酸脱氢酶系，它包括三种酶和六种辅因子，催化丙酮酸迅速地进行连续几步的氧化脱羧反应。根据酶分子的性质和大小分为三类：

一)、酶的辅助因子（辅因子）辅因子辅酶：与酶蛋白结合较松，用透析法可以除去的小分子有机物。辅基：与酶蛋白结合较紧，不能用透析法除去的小分子有机物。金属离子：如Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分;辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体，决定催化的性质或反应类型

辅因子的定义：酶分子中对热稳定的非蛋白质部分。

辅因子的类型：包括金属离子和小分子有机化合物，后者又依据与酶蛋白的结合程度不同分为：辅酶和辅基*各部分在催化反应中的作用酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。

金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。金属离子是常见的辅助因子

金属酶金属离子金属激活酶金属离子过氧化氢酶Fe2+丙酮酸激酶K+，Mg2+过氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶Mn2+，Zn2+谷胱苷肽过氧化物酶Se蛋白激酶Mg2+,Mn2+己糖激酶Mg2+精氨酸酶Mn2+固氮酶Mo2+磷脂酶CCa2+核糖核苷酸还原酶Mn2+细胞色素氧化酶Cu2+羧基肽酶Zn2+脲酶Ni2+碳酸酐酶Zn2+柠檬酸合酶K+金属酶和金属激活酶

酶的辅因子作用酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。(1)传递电子体：如卟啉铁、铁硫簇；(2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)传递酰基体：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)传递一碳基团：如四氢叶酸；(5)传递磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：

转氨基，如VB6；传递CO2，如生物素。小分子有机化合物在催化中的作用

二)、酶的活性中心必需基团：酶分子中若经化学修饰使其结构改变，则酶的活性丧失的基团；一些与酶活性密切相关的基团。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位活性部位以外的必需基团结合基团催化基团专一性催化性质结构基团维持构象所必需三)、酶的分子结构与催化活性酶的活性中心：酶分子中能与底物特异的结合并催化底物转化为产物的区域。（这个区域具有一定的空间构型，且有关基团靠得比较近，而它在一级结构中却离得比较远）溶菌酶的活性中心*谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团；*色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团；*A~F为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。63氨基酸侧链未折叠蛋白质结合部位折叠蛋白质氢键盐键底物酰基水构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。活性部位（活性中心）的特点：1.活性部位仅占酶的整个体积的相当小的一部分。2.

活性部位是个三维的实体。3.结合的专一性决定于活性部位中精确规定的原子的排列。4.大多数底物都以相当弱的力结合在活性部位。5.

活性部位往往是裂隙、裂缝或“口袋状”等,且可深入酶分子内部，并多为ａａ残基的疏水基团组成的疏水环境。三.酶高级结构与活性的关系（一）活性中心与活性直接相关胰蛋白酶的空间结构（活性中心）（二）聚合与解聚—四级结构与酶的活性的关系1.聚合与解聚时均有活性如：天冬氨酸转氨甲酰酶，每个亚基都有一个活性中心。2.聚合时有活性，解聚时无活性3.解聚时有活性，聚合时无活性如：cAMP依赖性蛋白激酶（四聚体，两个催化亚基，两个调节亚基）如：乙酰CoA羧化酶四、酶原的激活酶原——没有活性的、酶的前体。酶原的激活——酶原在一定条件下，转变成有活性的酶的过程。酶原激活的机理：酶原一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下分子构象发生改变形成或暴露出酶的活动中心实质是:酶活性部位形成或暴露的过程酶胰凝乳蛋白酶原的激活Ile与Arg间切酪氨酸与苏氨酸酶原激活的生理意义

避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。

有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。如:凝血酶第三节酶的作用机制一、酶促反应与活化能任何反应都需要一定的能量，有了能量分子就能活化成活化分子

1、活化分子：能量达到或高于分子平均能量的分子（三好学生成绩高于平均）。2、活化能（是个能障）：分子由基态到活化态所需的能量。

在一个反应体系中，活化能越高，活化分子越少，反应速度越慢；否则反之。（比喻跳高：跳过1.5米才得60分，很多达不到；如果要跳过1.0米获60分的话，很多达到）促使化学反应进行的途径：用加热或光照给反应体系提供能量。使用催化剂降低反应活化能。酶和一般催化剂的作用就是：降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。酶促反应的机制

———降低反应的活化能活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。据估计有酶催化可降低100万倍.反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物二、中间产物学说E+SESE+P中间产物存在的证据：1.同位素32P标记底物法

2.吸收光谱法要点：酶促反应改变了原反应的过程（历程）S具有一定的活化能，当S和E结合成过渡肽的中间物时，要释放一部分结合能，这部分能量的释放，使得过滤态的中间物处于比E+S更低的能级，因此使整个反应的活化能降低，使反应大大加速。S同E结合成中间复合物是一种非共价结合，依靠氢键、离子键、范德华力等次级键来维持。

酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。三、决定酶高效性的机制

（一）邻近效应和定向效应邻近：是底物向酶的活性中心靠近，从而形成局部区域高浓度（底物浓度从10—3M→102M，相当于将底物浓度浓缩了10万倍）定向：S有规律地排列在活性中心周围（打饭时排队而不是一窝蜂）反应速度与底物浓度成正比，反应速度这时最少可扩大1000倍，最高可达100万倍。邻近效应和定向效应是加速反应速度的主要原因（二）共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括His的咪唑基，Cys的巯基，Asp的羧基，Ser的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。胰凝乳蛋白酶反应的详细机制结合底物His57质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物羰基产物释放四面体中间物的瓦解水亲核攻击羧基产物释放(三)酸碱催化：酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。His残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。

广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）四、决定酶特异性的机制（一）锁钥学说

1894年，E.Fischer最早提出的，是锁头和钥匙的关系，一个底物一个酶，就象一条钥匙一把锁一样。只能解释绝对专一性，不能解释相对专一性。（二）诱导契合学说特点：酶和底物原有的构像并不是十分吻合，而是结合时才配对、契合，这就可解释酶既可催化一个S，也可催化一类S发生反应；既可催化正反应，也可催化逆反应，无论从那些方面来说都可解释酶的特异性。要点：D.E.Koshland,1958年提出：酶的构像并不是固定不变的，（特别是酶的活性中心的构像），活性中心的构象有柔性（是可变的，什么时候变？），当S与酶结合时，底物诱导酶的活性中心的构像发生有利于与底物结合的变化（从哪些方面变？），使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。+羟肽酶的诱导契合模式研究的内容：是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。或者说：是研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述的科学。影响因素包括有：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。第四节酶促反应动力学

酶促反应动力学研究的意义有助于阐明酶的结构与功能的关系，也可为酶作用机理的研究提供数据；有助于寻找最有利的反应条件，以最大限度地发挥酶催化反应的高效率；有助于了解酶在代谢中的作用或某些药物作用的机理等。

一、酶促反应的速度酶促反应速度：一定时间内底物的减少量或产物的生成量。通常是用后者来表示，而且是测定反应的初速度。102030405060min产物生成量酶反应进程曲线二、影响因素---温度的影响影响的情况有两个方面：酶的最适温度——温度既不过高以使酶失活，也不过低以使酶活力受到抑制，从而使酶表现出最大活力时的温度。2、达到一定温度时，温度升高，反应速度下降。是因为温度升高（通常为600C时），酶蛋白变性，酶失去了活力。1、低温时，温度升高，反应速度加快。一般的化学反应中，温度升高100C，反应速度增加2~3倍即Q10为2-3，在酶促反应中仅提高1~2倍。主要是增加了初动能。Tv最适温度二、温度的影响二、温度的影响不同生物，在其他条件不变时，有一定的最适温度，人体最适温度370C，动物35-400C，植物和微生物32-600C。有另外：液化淀粉酶的最适温度900C最适温度不是酶的特征物理量。酶适合在低温下保存（低温时，活力低，但不失活）。三、PH的影响酶表现活性有一定的PH值范围，也有最适PH值。酶的最适PH值——酶表现最大活力时的PH值。偏离了最适PH值，酶的活力降低；偏离了PH范围，酶的活力丧失。0酶活性胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。三、PH的影响不同的酶有不同的最适PH值：人体及动物体内大多数酶为中性：6.5—8.0，如血液中的酶为7.2—7.6，肠中的酶7.6-7.8，但有另外:胃酶为1.9，精氨酸酶为9.8。植物和微生物的最适PH值为4.5—6.5.酶一般放在缓冲液中保存。pH对酶作用的影响机制酶蛋白的结构、酶活性部位的解离状态、辅酶的解离、底物分子的解离。

从而影响酶与底物的结合以及对底物的催化效力。四、酶的浓度的影响在有足够底物和其他条件不变的情况下：

v=k[E]EvK：反应速度常数五、底物浓度的影响（一）影响的情况有三种（即分为三个阶段）：1、[S]很低时，随着[S]升高，v加快，且成直线关系，属一级反应；2、[S]一定量时，[S]升高，v加快，但比例下降，属混合级反应；3、[S]较高时，即[S]＞＞[E]，[S]升高，v不变（无所谓），属零级反应。[S]vVmax一级反应

v=k[S]零级反应

v=k[E]混合级反应Km1/2Vmax1902年，VictorHenri发现：底物浓度对酶促反应速度影响是非线性关系五、底物浓度的影响（二）米氏方程式（反映底物浓度[S]

应速度v间的定量关系的公式）

v=——————Vmax·[S]km+[S]1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。

根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:(三)米氏方程的推导：当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2米氏常数是反应最大速度一半时所对应的底物浓度当S<<Ｋm时，v正比于[Ｓ],呈一级反应当Ｓ>>Ｋm时，v＝Ｖm，呈零级反应

米氏双曲线四.米氏常数Km的意义:1.米氏常数的含义：由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。2.是酶的特征物理常数，但其应用是有条件的：不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。3.表示酶与底物之间的亲和程度：Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。4.判断酶的最适底物

Km最小的底物5.计算一定速度下的底物浓度

V=80%Vmax时，(S)=？由：

0.8Km+0.8(S)=(S),0.8Km=0.2(S)(S)=4Km

又:V=99%Vmax,(S)=99Km6.了解酶的底物在体内的浓度水平

Km≈(S)7.判断反应的方向

Km最小的反应8.判断抑制作用的类型（四）Km的求法1、双倒数作图法2、Eadie—Hofstee方程1.双倒数作图法

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式即得米氏常数（Km）的测定测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—

双倒数作图法。1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km1/V

~

1/[S]作图V/(S)VmaxVVmax/Km斜率=-Km2.Eadie-Hofstee方程由：V*[(Km+［S］)

/［S］]=VmaxV*Km/［S］

+V=VmaxV=-Km(V/［S］)+VmaxV

~

V/［S］作图方程两边乘以(Km+［S］)/［S］3.Hanes作图将双倒数方程两边乘以（S）即得:

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax[S]Km1

=

+

[S]

V

VmaxVmax[S]/V∽[S][S][S]/V斜率=1/VmaxKm/Vmax四.双底物双产物反应

A+B P+Q

双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类:

双底物双产物的反应

序列反应（sequentialreactions）

乒乓反应（pingpongreactions）

有序反应（orderdreactions）

随机反应（randomreactions）双底物反应AQPBEQEAB-EPQEEAEA+BP+QE（一）.顺次反应顺次反应：所有的底物都必须在反应前以及产物释放之前与酶结合的反应1.有序顺次反应A,B与酶的结合是有顺次的，不是随机的，A不与酶结合，则B不能与酶结合如：NAD++CH3CH2OH----NADH+H++CH3CHOPBBAEBEAQEPQAEEPEQEAB-EPQ2.随机顺次反应（二）.乒乓反应AQBPE/

B=EQE/EEA=E/PEA，B哪个先与酶结合无关，P，Q哪个先释放也不重要如：肌酸激酶(依赖ATP)主要特征：底物与酶的结合和产物的释放是交替进行的。如转氨酶(依赖磷酸吡哆醛)六、激活剂对酶促反应的影响1.概念：凡是能提高酶活力的物质(简单化合物)都称为酶的激活剂,（activator)。2.成分：其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-、GSH、VitC等；如:

Mg2+对磷酰基转移酶、脱羧酶，Cu2+对一些氧化酶，Cl-对唾液淀粉酶有激活作用。一些有机小分子:如VitC，谷胱甘肽，巯基乙醇等，巯基乙醇对巯基酶有激活作用。3.功能：1）.这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，

2）.也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；4.特点：1）.一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则不一定是激活剂，可能发生抑制作用；如：Mg2+对肌球蛋白腺三磷酸酶的活性有抑制作用2）.对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。七抑制剂对酶作用的影响使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂。酶降低活性的情况有三种：1、失活作用——酶的活性丧失。原因：酶的高级结构被破坏而变性。2、抑制作用——抑制酶的活性，使酶的活性全部或部分表现不出来。3、去激活作用——酶没有变化，是去掉了激活剂，没有激活剂酶的活性很低，如用金属离子螯合剂——EDTA（乙二胺四乙酸盐）去除金属离子。从根本上来说没有丧失活性，只是活性暂时无法表现出来。抑制剂导致酶的活力降低或丧失，使酶促反应速度降低的作用称为抑制作用。（一）抑制作用的概念抑制作用的特点a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。七抑制剂对酶作用的影响1.不可逆抑制作用：抑制剂与酶以共价键结合，不能通过超过滤或透析法除去抑制剂使酶的活性得到恢复。S+EESE+P+I↓EIE—SH+ICH2COOH→E—SCH2COOH+HI（二）抑制作用的类型

抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：

实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX路易士气巯基酶失活的酶酸二巯基丙醇(BAL)

巯基酶BAL与砷剂结合物七抑制剂对酶作用的影响2、可逆抑制抑制剂与酶的活性中心或活性中心以外的基团以非共价键结合，反应是可逆的，即抑制剂可通过超过滤、透析法除去后使酶的活性得到恢复。七抑制剂对酶作用的影响（1）竞争性抑制：定义：抑制剂与底物的结构相似，因而与底物竞争地与酶的活性中心结合，从而减少了酶的作用机会，降低酶的反应速度。竞争的部位：是结合基团（抢位置），抑制剂在结构上与底物相似（条件相当）。例子：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制；

磺胺类药物的抑制。抑制作用的特点：抑制作用的强弱取决于底物浓度与抑制剂浓度的比例。要排除抑制作用必须加大底物浓度（使抑制剂没有市场）。动力学特点：与最大反应速度无关，与米氏常数有关（抑制剂是可恶的第三者插足），只要有抑制剂的存在，酶与底物的结合下降，米氏常数会增大。酶的活性中心底物抑制剂产物底物和抑制剂能结合酶活性中心抑制剂阻止底物与酶的结合

在可逆的竞争性抑制中，抑制剂通常是酶的天然底物结构上的类似物，两者竞争酶的活性中心。*举例1.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸2.磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制对氨基苯甲酸与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶S+EESE+P+I↑↓EIv=———————V[S]km(1+[I]/ki)+[S]ki=[E][I]/[EI][S]vV/2kmkm′无I有I抑制作用的特点：抑制作用的强弱取决于底物浓度与抑制剂浓度的比例。要排除抑制作用必须加大底物浓度（使抑制剂没有市场）。动力学特点：Vmax不变，Km增大。（抑制剂是可恶的第三者插足），只要有抑制剂的存在，酶与底物的结合下降，[I]浓度越高，S与E的结合能力越低，Km就越大。（2）非竞争性抑制：概念：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。特点：抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；抑制程度取决于［I］；非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。活性中心抑制剂位点抑制剂的结合不影响底物与酶的结合底物-酶-抑制剂复合物产物不能生成无抑制剂时产物生成非竞争性抑制作用的速度方程：有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；Km值不变。非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图：

非竞争性抑制作用的动力学特点是Vmax变小，而Km不变。（3）反竞争性抑制：概念：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：特点：抑制剂只与酶－底物复合物结合；抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度；非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。反竞争性抑制作用的速度方程：L-苯丙氨酸等一些氨基酸对碱性磷酸酶的作用是反竞争性抑制反竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图：各种可逆性抑制作用的比较

第六节、酶的分离纯化与酶活力测定一.酶的分离纯化1.基本原则

提取过程中避免酶变性而失去活性防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等要求在低温下操作加入的化学试剂不使酶变性操作中加入缓冲溶液2.基本操作程序选材：微生物（微生物发酵物:胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。3.酶的制剂形式固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）液体：溶液4.保存低温下短期保存0-4℃（固体）-20〜-70℃（液体）二.酶活力及其测定方法（一）.酶活力概念酶活力：又称为酶活性，酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，。（二）.酶活力的表示方法-酶活力单位(unit,U)

规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量(底物的减少量/产物的增加量)所需的酶量(质量)。1.酶活力单位的基本定义酶活力通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。反应速度可用单位时间内单位体积中底物的减少量/产物的增加量表示.酶活力∝反应速度∝底物的减少量/产物的增加量2.国际单位IU（internationalUnit）：在最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1μmol产物(消耗1μmol底物)所需要的酶量为一个酶活力单位。“Katal”单位：是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat

如果底物有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。

在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。3.酶活力单位某些习惯表示法在实际使用中，不同酶有各自的规定，如：DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量为一个酶单位。

。α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶单位。4.酶的比活力比活力:指每mg酶蛋白质/蛋白氮所含的酶活力单位数。比活力=U或Kat/mg酶蛋白或蛋白氮(U或Kat/ml酶液,或U或Kat/mg酶制剂）比活力表示酶制剂的纯度的一个指标。5.酶活力中心转换数酶活力中心转换数Kcat:表示酶的最大催化的活性的一种量度,又称酶的分子活性。单位时间内(sec.)每一催化中心的活性或活性中心所能转换底物的分子数，或每mol酶活性中心单位时间转换底物的mol数.转换数=k3=Vmax/(Et)1M酶活性中心单位时间内转换底物的摩尔数([S]/M)6.回收率和纯化倍数回收率=纯化倍数=每次活力第一次活力每次比活力第一次比活力*100%纯化步骤总蛋白（mg）活力IU比活力IU/mg回收率%纯化倍数匀浆液1.4*1062.8*10621001等电点沉淀4*1041.4*106355017.5DEAE柱色谱8*1031*1061253662.5（三）.酶活力测定酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物的生成（增加）量或底物的消耗（减少）量。即测定时确定三种量：

①加入一定量的酶；②一定时间间隔；③物质的增减量。1.测定酶活力的方式反应计时法：测定完成一定量反应所需的时间。反应计时必须准确。反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液并立即计时。反应到时，要立即灭酶活性，终止反应，并记录终了时间。终止酶反应。反应量的测定法：测定单位时间内酶催化的化学反应量。测底物减少量或产物生成量均可。在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量2.酶活力测定的分析方法具体物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质通过定量分析法测定。光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法或荧光光度法、酶偶联法测出的化合物。化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性，如PH测定法。放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。

常用的方法有：

第七节酶的多样性（自学）一.多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。二.同工酶：指分子结构及性质不同，但能催化同一反应的一类酶

HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脱氢酶的同工酶*举例：乳酸脱氢酶(LDH1～

LDH5)心肌肝脏骨骼肌肾脏红细胞乳酸脱氢酶同工酶形成示意图

多