色谱原理讲解

高效液相色谱分析原理及流程2011-6-20中国化工仪器网 点击：227高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（5um-10um）、传质快、柱效高。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。高效液相色谱分析原理（一） 高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。（二） 高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。高效液相色谱的类型（一）吸附色谱在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。（二） 分配色谱正相分配色谱正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。反相分配色谱这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。通过使用的流动相是水一甲醇和水一乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的PH值，例如，如果样品有一个一COOH基团，使流动相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。在调节PH值中，保持PH值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，当加入盐以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的PH值。（三） 离子交换色谱这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用NaCI或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在210nm，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。（四） 凝胶色谱凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography),简称GPC。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脱液有THF，Chloroform等等。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(GelFiltrarionChromatography),简称GFC。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。文章链接：中国化工仪器网/News/Detail/20103.html气相色谱的原理当载气把被分析的气态混合物带进装有固定相的色谱柱时，由于各组分的分子与固定相分子间发生吸附、脱附或溶解、离子交换等物理化学过程，使各组分的分子在载气和固定相的两相间分配系数不一样，经反复多次分配，不同组分在色谱柱上移动速度不一样，经过色谱柱后，各组分按先后次序流出色谱柱，使各组分得到完全分离。气相色谱的特点分离效能高。一般填充柱有几千块理论塔板，而毛细管柱理论塔板达103-106，因而可以分析沸点相近的组分和十分复杂的混合物。例如60m长的毛细管柱可将汽油含10个碳以内的组分分离出240个色谱峰。选择性高。气相色谱法可以分离化学结构极为相近的化合物。例如多环芳烃的异构体、二甲苯的三种异构体等，用其它方法分离相当困难，但气相色谱法则比较轻易。高灵敏度。与气相色谱仪配用的高灵敏检测器对待测物的最低检测质量可达0.1-10pg或更低。因而适合于微量有机物分析，例如采用电子捕捉检测器，可测0.1.pgY/-666。分析速度快。一次色谱分析短者几秒钟，长者几分钟到几十分钟完成。特别是目前气相色谱仪可由微处理机控制并配数字处理系统，速度就更快。样品用量少。由于气相色谱灵敏度高，需要的样品极少，一般进样几个微升即能完成分析。分离和检测能一次完成，这也是气相色谱的特点。其它的分析方法，如紫外、红外、质谱等均需纯品，对混合物则需分步进行分离和检测。但是，气相色谱法的应用有其局限性。即只能测定单一物质的量，不能测定某些同类物的总量；在进行定性和定量分析时，需要被测物的标准品为对照，而标准品往往不易获得，这给定性鉴定带来困难。气相色谱常用的名词、术语及定义⑴色谱图样品各组分经色谱柱分离后进人检测器，它们在检测器中引起响应并作为分离时间的函数被记录下来，这样一系列表示组分性质、含量信号一时间曲线就是色谱图。对于微分型的检测器，信号近似于正态分布曲线，色谱峰面积正比于组分质量。色谱图是气相色谱法定性、定量的依据，也是衡量仪器好坏的依据。⑵基线在操纵条件下，只有纯载气经过检测器时，记录仪所记录的检测器输出的信号一时间曲线为基线。理论上是一条直线，但在高灵敏度量程时，基线常有一定的噪声和漂移。噪声：基线在短暂时间的波动，以波动的峰值表示。噪声大往往和基流高联系在一起。漂移：基线在一段较长时间（如几十分钟）内缓慢改变。噪声是叠加在漂移上同时表现出来。⑶色谱峰在操纵条件下，当载气带着样品组分经过检测器时，检测器