胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量

胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述一、前言胶原蛋白（collagen）是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白，约占人体总蛋白的三分之一,存在于细胞外间质，是具有三股螺旋结构的蛋白质家族。胶原是人体重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。胶原是一个大的蛋白家族，至少有15个型别，各型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以?型胶原分布最广，胶原蛋白（或称胶原）是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维（collagenousfibril）可将其分为原纤维胶原蛋白（fibrillarorfibril-formingcollagen）和非原纤维收原蛋白（nonfibrillarornon,fibril,formingcollagen）两大类。目前己发现的胶原蛋白类型己不下19种，原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI型胶原，在体内以胶原纤维的形式存在。胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、软骨、韧带等器官的基本结构物质，使这些器官具有很高的抗张强度。胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型胶原，其余均属于非原纤维胶原蛋白。非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特征，即三股螺旋结构，但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按其,,27超分了结构可进一步分类。（l）结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白（fibrilassociatedcollagenswithinterruptedtripleheliceFACIT）包括IXXIIXIVXVIXXI型胶原。（2）形成网状结构的胶原蛋白包括IVVIIIX型胶原。（3）形成串珠状纤维（beadedfilament）的胶原蛋白有VI型胶原。（4）形成固着原纤维（anchoringfibril）的胶原蛋白，有VII型胶原。（5）有跨膜区的胶原蛋白，有XIII和XVII型胶原。（6）结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。胶原不仅作为组织的支持物，而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响。胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越性，因此近20年来已被广泛用于临床（近年来，世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损，覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。二、胶原蛋白的提取胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族，是细胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。到目前为止已发现脊椎动物的胶原类型达十多种之多，各型作用不一。胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病，在肿瘤的发生与转移中，胶原的分布和类型也发生改受。因此在提取时常将各型分别提取。目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法，在酸性条件下，I型和Ill型胶原沉淀的盐浓度临界点相近;在中性条件下，III型和IV型胶原沉淀的盐浓度临界点又很接近。因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间长，易发生胶原变性。主要的提取方法分述如下:I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶原，在脏器纤维化病理过程中，I型和II型胶原起着重要作用。I型胶原是结缔组织间质中最主要的成分，一般制品多以I型胶原为材料（文献上I型胶原的提取一般采用多次超速高心的办法。李成章、樊明文从人胚骨中提取了I型胶原，用于胶原制品的制作。采用胚胎骨组织来提取胶原（一般认为骨组织仅含有I型胶原，选用骨组织作为提取原料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原（他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24,48h,取上清缓慢加入研磨精细的NaCl（终浓度为4mol/L），搅拌过夜离1心35OOOXg,20min（下同），去上清，其沉淀物加入0.5mol/LHAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris,HCI（终浓度为0.01mol/L）,5mol/LNaOH（调pH至7.4），NaCl（终浓度为4mol/L），搅拌过夜，离心，去上清（沉淀以4mol/LNaCI（0.05mol,LTris,HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析（平衡后NaCl浓度为10,）离心去上清，沉淀物用0.5mol,LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所有液体及操作温度均为4?。为提高抽提纯度，骨粉应越细越好，脱钙必须完全（采用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白（osteonectin）随之溶去，有利于提高胶原的纯度（抽提的次数不应太少，否则纯度不够，抽提次数太多则易发生胶原变性（他们所用抽提次数为3,4次，结果表明，所提胶原具有较高纯度，可用于胶原制品的制作。首都医科大学宣武医院普外实验室的孙海晨、李铎、刘爽、孙家邦对以往的I型胶原蛋白的提取作了一些改进，只进行了2次超速离心减少了步骤。一般文献中在I型胶原的-1提取过程中要不断使用不同浓度的NaCI,0.05mol?LTris-HCI缓冲液反复进行离心、抽提。他们实验将其改为在3,醋酸的酸性条件下，直接加入40mL30,浓盐水，不仅减少了步骤还节省了试剂和时间。他们的方法为:取鼠尾浸入75,酒精消毒30min移入PBS液中洗2次，去皮、抽取鼠尾腱，放入PBS液中洗2次，高速组织粉碎机粉碎后放入3,醋酸（每尾200mL），48h，1.2万克离心2h。吸取上清加入30,浓盐水40mL盐析。离心4000g，30min。将沉淀溶入50mL0.1,醋酸内，置透析袋内与500mL1mol,L的HCI透析48h，其间换水5次。这样可得到透明清亮的胶原溶液。加入0.15mL氯仿，敞开瓶口，用无菌纱布包住，置无菌工作台48h使氯仿挥发。取5mL溶液经SEXTRYTM冷冻干燥机冷冻干燥，定量胶原浓度为3.5g/L。王凯慧、李雅杰等从猪囊尾蚴中提取胶原蛋白，用紫外分光仪、SDS,PAGE、透射电镜和ELISA等方法对猪囊尾蚴胶原蛋白作了初步分析。表明：(D猪囊尾拗中含有一定量的胶原蛋白；(2)胶原蛋白主要以I型为主，分子量在80kDa,130kDa之间；(3)通过酶联免疫吸附实验，检测其抗原性，证明其对人具有很强的免疫性。刘德莉、徐蓉等从鸡趾肌腱中提取了I型和II型胶原。方法为:在9mL细胞培养液中，加入ImL蛋白酶抑制剂(0.1mol/LTris,HCI、pH7.4、0.4mol/LNaCl、0.25mol/LEDTA、20mmol/LPMSF及10mmoL/LNEM)0.33mL乙酸溶液(0.5mol/L)及胃蛋白酶溶液(10g/L),混匀后，于4?温和搅拌6h在4?离心(16000r/min)30min。留上清液，缓慢加入410mg氯化钠粉末，边搅拌边混匀溶解，于4?冰箱盐析过夜。第2天取出，高速低温离心(l6000r/min)30min，取沉淀物，冷冻干燥2h，即为培养液中的胶原提取物。将组织标本称重后，以PBS洗净，剪碎至lmm大小，置10mL0.5mol/L乙酸溶液膨胀过夜。4?匀浆(l0000r/min)5min，加入胃蛋白酶(酶量与湿组织之mg比为1:100)，于4,冷室搅拌消化6h,加TriS至pH7.4中止酶解，再4?离心(16000r/min)45min。取上清液，精确称取氯化钠(0.7mol/L，于10mL上情液中加入410mg氯化钠)，在冰浴中，于上清液中边缓慢搅拌边加入氯化钠至彻底溶解，置4?冰箱盐析过夜，再4?离心(16000r,min)45min。取沉淀物，冷冻干燥2h，即为组织中的胶原。王新禾、张月娥等以限制性胃蛋白酶消化和分步盐析法从人胎盘中提取高纯I、III型胶原分别免疫家兔，经兔疫吸咐制备单一特异的抗人I、III型胶原抗血清。他们的方法为取胎盘去除脐带和羊膜、捣碎、匀浆；限制性胃蛋白酶消化，4?20h(每20g湿重组织加入0.05%胃蛋白酶、0.5mol/L醋酸100ml);消化上清液（酸性）中加NaCl至l.Omol/L，沉淀为胶原混合物:随后在中性条件下分别以1.5mol/L、2.5mol/LNaCl盐析，反复数次分别得到I、III型胶原的初纯品；用DE,52柱层析去除酸性大分予，得到纯化的I、III型胶原。II型胶原是关节软骨中主要细胞外间质之一，多种风湿性疾病的发生与II型胶原异常有关。现己知类风湿关节炎发病与II型胶原自身免疫反应有关，用II型胶原免疫某些动物2可诱导出多关节炎，然而口服II型胶原可通过诱导免疫耐受来治疗类风湿关节炎。梅焕平、张源潮、李华研究了II型胶原的微量提取和纯化方法。

O.OQ1M醋赧透析2天”毎天更换透析液，蒸懈水透析1天O.OQ1M醋赧透析2天”毎天更换透析液，蒸懈水透析1天r$聚乙二阳6000侬耶克窣干燥3X.ttWllffi胶员平均箫2.5克艾节软骨可疚11型胶原】0叫）兔关节透明软骨洗Sifi.lOXTB#毎克软骨加lOrnl4M盐KM/Q.OSMTrtspEU.5.■TC下搅拌24小时,12000牛3分钟用工沉淀加均倍体积①讯酣酸胃蛋•白薦pH2,5“3（盒胃蛊厂I朝lOmp/lOOnjJ^海JS钠20n^/IflOml）,搅It24小时同Y10000『5分钟卫工上清液（況淀部分重复傅蛋白稠酶解•抽捉」次）0.2M氯比钠/D.OSM7為HO|⑷上透析透折内液按誓克软骨比I克已处理的DEAE纤维素比例混合1小时!200%30分神山乜上清液加氨基已酸*便其锻度达0_1址工4氮化钠粗析24小时上弋I50000^30分钟・4贮上淸液加氮化衲使浓度达44M愉器24小时*4覽l20（X^抽分邯,4*沉淀物用蒸谱水溶斛方法见上表。研究采用限制性胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋结构不受影响，故仍保持II型胶原分了完整性，抗原性基本不受影响。微量提取法主要有如下技术改进：(1)使用合适浓度的氨基己酸可有效地抑制胶原酶活性，减少胶原蛋白破坏，提高II型胶原收率；(2)在中性条件下只用2.4M氯化钠盐析去除I型胶原蛋白，再用4.0M氯化钠沉淀II型胶原，沉淀物经透析后使需干燥溶液体积减少80,，使低温真空干燥容旯完成，又减少了II型胶原丢失。秦定一、单英等参照Byers等方法并略作改良分别从家兔和胎儿2种不同皮肤中提纯2了III型前胶原肽。方法为:所有操作均在4?进行，将皮肤切成约lmm大小碎片，置于pH7.4，150mmol,LTris,HCI20mmol/LEDTA、10mmol,LPHCH2S02F、10mmol/LPMB溶液中匀浆，在4?下提取48h。2000r,min离心lOmin，上清中加入。W(硫酸铵)=20%。离心15000r/min20min，用上述提取液重溶沉淀，加W(NaCl)=10,，30000r/min离心20min。用pH7.6，200mmol/LNaCl、50mmol/LTris-HCI溶液溶解沉淀即为III型胶原(CollagenTypeIII，CIII)和III型前胶原(ProcollagenTypeIII，PCIII)粗提物。将上粗提物充分透析后上DEAE-32纤维素柱层析，用pH7.5,2mol/L脲、20mmol/LNaCl、30mmol/LTris-HCI溶液平衡。洗脱，以去除酸性糖蛋白。为分离CIII与PCIII,再次经DEAE-32纤维素柱层析，用pH7.0,2mol/L脲，0.02mol/LNaCl、0.05mol/LTris,HCI溶液平衡、洗脱，待穿过峰结束，用0.02,0.2mol/LNaCl梯度洗脱，分别收集CIII与PCIII。将PCIII溶于pH7.4，0.2mol/LNaCl、0.05mol/LTris-HCl、0.005mol/LCaC12、2.5mmol/LPMB溶液加入细菌胶原酶，37作用4h,置冰水终止酶反应。酶消化产物在PH8.5,0.2mol/L碳酸氢胺溶液中透析平衡。再经SephadexG,50凝胶过滤，分批加上酶消化产物进行洗脱，收集第一峰，超滤浓缩，置pH8.6,2mol/L脲、0.05mol/LTris-HCl缓冲液中透析。过DEAE-52纤维素柱层析用0,0.35mmol/LNaCl梯度洗脱，收集主峰即为PIIIP。柴明胜、陈金国、叶仲贤、朱炳钗用人胎盘经胃蛋白酶消化,氯化钠分级盐析沉淀后，进一步经过DEAE-52和CM-52柱层析纯化提取IV型胶原。他们的方法为取人胎盘2只,剥离泡膜和结缔组织后剪碎,分别用蒸馏水和含蛋白酶抑制剂0.05mol/L,pH7.2Tris-HCI缓冲液漂洗使胎盘组织由红变白后制成匀浆。再用该缓冲液在4?洗提4h，离心后沉淀加入0（5mol,L醋酸溶解，边搅拌边加入胃蛋白酶，在6?提取24h。离心收集上清液，逐渐加入氯化钠，使其浓度为1.2mol,L，然后搅拌过夜。沉淀用0.lmol,L醋酸溶解后，用0.05mol,LTris-HCI，PH7.4，0.2mol,L氯化钠透析过夜（去除沉淀后逐渐加入氯化钠使其浓度为2mol,L（所获沉淀即为IV.C粗品。将粗品溶于0.05mol,LTris-HCI,PH8.6,2mol,L脲素，0.2mol/L氯化钠缓冲液中，并用相同的缓冲液在4?透析24h后，用DEAE-52层析。收集穿过峰再用0.04mol,L醋酸钠，PH4.8,2mol,L脲素透析后用CM-52柱层析，经0,0.3mol,L氯化钠梯度洗提，第一峰即为IV.C纯品，透析除盐、冻干于20保存。氨基酸分析表明甘氨酸含量占30,，羟脯氨醚占13,，两个链的分予量分别在95000和70000，与Timpl报道相似，符合IV（C特征。姚敏捷、寇丽筠等人从胎盘中提取IV型胶原蛋白。方法为取正常分娩的胎盘，冰水冲去血液，置-20?冰箱冰冻2,3h后剪成小块，制备匀浆。相继用中性盐提取液、0.5mol/LHAc分别抽提数次去除杂蛋白和血红蛋白，至组织呈乳白色;胃蛋白酶消化，沉淀出I、III型胶原后的上清中含有IV型胶原;加NaCl至4.5mol/L，再以1000Xg离心lh弃上清，沉淀溶于0.lmol/LHAc中，再加NaCl至1.2mol/L，离心弃上清;沉淀加于0.5mol/LHAc，并进行透析，1000Xg离心lh，上清含IV型胶原粗提物。将此粗提物在起始缓冲液（0.04mol/L醋酸钠pH4.82mol/LUrea）中充分透析，加至平衡好的CM,52纤维素层析柱上，线性梯度洗脱（NaCl浓度从0.04,0.4mol/L），于230nm监测至吸光值回到基线。收集的蛋白分别是IV型胶原。用0.001mol/L醋酸分别透析（＞48h）（以上操作均在4进行）。冷凉干4燥后-50?冰箱保存。V型胶原（ColV）与其他型胶原一样，由3条多肽链构成，在分子构成上有多种形式许祖德、张月娥等采用改良的Niyibizi方法从人的胎盘中提取a（V）、a（V）和a（V）123ColV的提取胎盘去脐带、绒毛膜和羊膜;匀浆，胃蛋白酶消化4、20h（300mg酶,300g湿重置于0.5mol,L甲酸中）；加NaCl到6%，离心，沉淀置于缓冲液A中，加NaOI到2mol/L，离心，上清液加NaCI到4.5mol/L，离心，沉淀置于含0.7mol/LNaCI的0.lmol/L醋酸中，离心，上清液加NaCl到1.2mol/L离心，留沉淀（ColV粗制品）。ColV的纯化ColV粗制品溶于0.5mol/L醋酸，加固体硫酸胺（144.7g/L），离心，上清液浓缩后，DEAE52柱层析（柱床3.5cmx12cm），用含0.02—0.34mol/LNaCI的缓冲液B梯度洗脱，留梯度洗脱第一峰前半部分（纯ColV）。姚敏杰、王天成、寇丽筠等同时从人胎盘中提取出III、IV、V型胶原并进行纯化、氨基酸组分分析和SDS,PAGE分析。其方法为用正常分娩胎盘，冰中冲去血液置-202,3h后剪成小块，在蒸馏水中浸泡，换水3,4次以迸一步去除组织中血液;沉淀组织制备匀浆，然后再相继用pH为7.5、0.5mol/LTris-HCl1.0mol/LNaCl、0.5mol/L醋酸液抽提6d以去除杂蛋白和血红蛋白，至组织呈乳白色为止；胃蛋白酶消化按20g湿重组织加入含有50mg胃蛋白酶的100ml0.5mol/L的醋酸中消化约4h，边消化边搅拌，1000r/min离心lh，在上清中加入研磨好的NaCl至0.7mol/L，边加边搅拌使III型胶原析出。根据III型胶原在中性条件下沉淀于

1.8mol/L的NaCl、II型胶原在酸性条件下沉淀于0.7mol/L的NaCI的特点经多次反复进行中酸性沉淀后获得了III型胶原的粗制品。瞄袅 聖题圖氮墓碟労析1旳V型mtBt原鱼廂lispro126nsAa-PSIuThr阳34鶴Ser173427Glu01K6[GO刚nsGlyJ33：H3Ah19Vtil2227S3Met号1flc17341申Leu11S3狐Tyr253W18291251?12HitfiIDSL/it?a715ArB6029畑舍计1财阿0为该卫邕」口励I即。千社站曲听咎刖各种羸基酢敘5沉淀出III型胶原的上清中含有IV、V型胶原，将其对1.2mol/LNaCl、O.5mol/L醋酸透祈;沉淀溶于pH为7.4、l.Omol/LNaCl、0.05mol/L的Tris,HCl缓冲液中，离心弃沉淀；NaCl加至4.5mol/L1000r,min离心lh弃上清，沉淀溶于O.lmol/L醋酸中，NaCI加至1.2mol/L离心弃上清，沉淀于pH=7.4、O.lmol/LNaCl、0.05mol/L的Tris,HCI缓冲液中，并用同一缓冲液透析,1000r/min离心lh，上清含IV型胶原粗提物;沉淀则为V型胶原的粗提物。[16,17]合III、IV、V型胶原的纯化III型胶原的粗提物在对pH为7.5、0.5mol/LTris,HCl、0.2mol/LNaCl,0.2mol/L尿素的起始缓冲液进行充分透析后，加人已平衡好的DEAE,32纤维素层析柱上，用同一缓冲液洗脱，紫外(230nm)监测至洗脱峰回到基线;收集的蛋白峰对0.001mol/L醋酸透析48h，冷冻干燥后-50?冰箱保存。IV、V型胶原在起始缓冲液pH为4.8的0.04mol/L醋酸钠、2.0mol/L尿素中充分透析，加至平衡好的CM,52纤维索层析柱上，线性梯度洗脱(NaCl浓度从0,0.4mol/L)，230nm监测至吸光值回到基线将收集的蛋白峰对0.001mol/L醋酸充分透析(,48h)，冷冻干燥后-50?冰箱保存。各型胶原的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果为III型胶原呈现出4条区带;IV型胶原有4条区带;V型胶原为3条区带。各型胶原氨基酸分析结果:III型胶原的Hypro/Pro之比值为1:2;IV型胶原中以HyPrO、Hyl含量最多，Arg、Ala则较III型胶原为低，IV胶原的芳香族氨基酸含量较其它类型的胶原为高；v型胶原为细胞外胶原，它的氨基酸组成见附表;以上各型胶原的氨基酸分析结果与国内外的报道相符超滤法用于胶原蛋白的分离超滤法就是应用孔径为10,20,,(或更大)的超滤膜来过滤含有大分子或微细粒子的溶液,使大分子或微细粒子从溶液中分离的过程。超滤的推动力是压差,在溶液侧加压,使溶剂透过膜得到分离。超滤所用的膜为非对称性膜,其表面活性层有孔径10-9,2X10-8,的微孔，能够截留相对分子质量为500以上的大分子和胶体微粒，所用压差为01,05,,,。超滤膜对大分子的截留机理主要是筛分作用,即符合所谓的毛细管流动模型。决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小和形状。除了筛分作用外,粒子在膜表面微孔内的吸附和膜孔中的阻塞也使大分子被截留。由于理想的分离是“筛分”,因此要尽量避免吸附和阻塞的发生。超滤也存在浓差极化的问题,即在溶质透过膜时,溶质在高压侧溶液与膜的界面上发生溶质的聚集,使膜面上溶质浓度高于主体溶液的浓度。超滤技术有不发生相变、能耗低、常温下进行等特点,在食品工业中已得到广泛的应用,在蛋白质浓缩与分离方面具有重要意义。超滤法分离大豆蛋白在国外已有报道,国内研究也证明超滤技术用于蛋白分离具有切实[18]可行性。崔岸、朱峰等对超滤法生产大豆分离蛋白进行研究，在小试规模基础上，探讨物料浓度、温度、操作压力、PH值、循环速度对超滤过程的影响。选取适宜大豆分离蛋白生产的超滤膜，超滤浓缩后，蛋白质的截留率高于95,，蛋白质的回收率达93(9,。以上的方法多用于生物领域的研究。提取过程多采用化学或者生物酶法并用盐析法进行提纯，提取产物纯度较高，但是工程比较复杂在工业领域应用较少，一般只用于科学研究。秘鲁海洋渔业研究所已研究成功一种利用加工过程中的鱼体废弃物提取胶原蛋白的方法。这种方法是利用加工鱼类后的废弃物如鱼皮、鱼骨、鱼鳞、鱼刺等杂物，用碱性溶液处理将其软化，然后再经过提取浓缩、脱色脱臭的工序，最终生产出无色、无味的胶凝状胶原蛋白。这种胶原蛋白可广泛应用于副食品、区药、化妆品等工业中，一般每十吨鱼废弃物可提取三吨成品胶原蛋白。提取胶原蛋白后的废渣仍可用作动物饲料。现在也有许多很多方法从皮革固体废料中提取胶原蛋白。如氧化法、酸法、碱法、酸碱交替法、酶法等。酸的脱铬能力很弱，且对胶原水解程度很大，明胶的产率低，胶原水解损失大，铬也除不尽，只能得到低级皮胶与小分子多肽。碱法比酸法处理的效果好，胶原产物的产率和铬6的脱除率都比较高在工业上已有应用。当酸处理与碱处理交替使用时，不仅脱铬效率要比酸处理法的高，而且所得到的胶原产物的稳定性和质量都要比酸处理法的高。值得注意得是，酸碱交替处理时要注意酸碱使用的顺序，一般认为先使用碱处理为好。缺点是处理的过程中会产生有毒六价铬且存放过久的铬革屑中铬脱不尽。酶的脱铬能力强弱与酶的品种控制条件有很大关系。酶处理法对胶原的降解程度较大，得到的产物分子小产率较低，铬的脱除率较低。单纯用酶处理含铬的革屑效果并不好。现在研究的热点是二步处理法，即先脱铬而后用酶水解。美国东部农业所MM.Taylor、EMBrown等用碱酶处理法提取用于化妆品、粘合剂、打印和照相工业等用的凝胶性蛋白产物，首先在温和的碱性条件下生成高分子量的凝胶性蛋白，然后用酶处理剩下的沉淀回收铬与小肽明胶和胶原蛋白产物的收率较高，但酶只能使用一次成本较高。用碱一一酶处理也有一些不足之处：）酶的稳定性较差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响锡，容易变性失活。12） 一般都是在水溶液中与底物反应，这样就使酶在反应系统中与底物和产物混和一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用，不仅增加生产成本，也不利于连续化生产。3） 反应后，酶与产物混在一起，成为杂质，给进一步的分离纯化带来困难。解决这些问题的方法之一就是酶固定化技术的应用。将酶与水不溶性载体结合制成固定化酶，固定化酶可在一定空间进行催化反应又克服了游离酶的不足之处，可反复连续使用，易与产物分离。目前国内研究蛋白酶固定化技术的人很多，黄雅钦、冷延国、黄明智用壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂制成固定化ASI.398中性蛋白酶制备水解明胶，固定化酶在使用12次后其活性仍为降低，所得水解产物分子量分步也较窄，证明固定化酶用于提取胶原蛋白也是可行的，但目前还未见有人把固定化酶用于皮革废弃物的处理。

J/lJIIIi■Hf&和朋%i'F学饗眠巧尸弔1=sn■VSfiSFHH11r*■ihP£■ril1.麼怎战F、卞ii1J'■1i« 1i1171?卄XV懒州卜1站1i肓HAffinlvIIIT1M1'■i•"Hi?■IIJi建上IR*L.Ah11IHII51II14II：?II1?AM畑弓MJI4K4Ml"嵌z1■tilI■ih¥lI1.WPKHKK7.ITKl药遞駅、lI-•18ThII?r.■1-.眾站：IlKII幼1ii吒尹WL.Flr211?■八圧抽號IBHYFRI1ii'富M-fK!匸恫山liiii入乂嬰酶斫屯丄呵*賀奧用三、胶原蛋白的结构胶原蛋白分子是一个长3000A直径为15A的杆状物，是已知的最长蛋白质之一。胶原8蛋白分子量是由3条大小相似的多肽链组成，3条多肽链都有螺旋构象。3条螺旋互相缠绕，形成一个超螺旋在这个超螺旋中，每个残基上升2.9A，每一圆周有3.3个残某。这三股多肽[19]互相以氢键形式结合起来。关静等用SDS,PAGE法对胶原海绵进行了较全面的结构分析。结果表明酶解法制备的胶原海绵除含有a、B、丫组份以外，还含有分子量高于Y及分子量低于a的组份;其中Y组份是a组份的三聚体，B组份是a组份的二聚体，符合胶原蛋白的结构特征;胶原海绵的Y组份及分子量高于Y的组份含量约是明胶标准品的两倍;分子量低于a的组份含量较少，与胶原蛋白的组成特征相符。胶原蛋白具有四级结构:氨基酸组成、肽链形成的三股螺旋结构、由原胶原分子形成的胶原纤维结构以及胶原纤维的编织结构。如下图阳十00丄甘一胶原蛋白具有四级结构:氨基酸组成、肽链形成的三股螺旋结构、由原胶原分子形成的胶原纤维结构以及胶原纤维的编织结构。如下图阳十00丄甘一・ 一护-)1-麗前”甘、丁1kA—104A单个的I型胶原分子量约285kD,宽14埃，长约3000埃。有三条多肽链组成。胶原是细胞外基质，由纤维细胞、神经上皮细胞、角膜上皮细胞、软骨细胞等合成，并分泌到细胞外的生物大分子，为纤维性蛋白多聚体，由它的前体胶原分子按照一定的形式排列聚合而成。原胶原分子是由3股a肽链链组成的超螺旋体，哺乳动物个体中有30种不同的多肽链构成约16种不同的胶原。[20,21]胶原的氨基酸组成有其特点，甘氨酸约占氨基酸总量的1/3，羟脯氨酸约占氨基酸总量的10,(羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白，而不存在于一般蛋白质中(各型胶原的氨基酸组成也各有特点，如I型胶原中羟脯氨酸与脯氨酸之比约为0(7,0.8(胶原蛋白的氨基酸组成有如下特征:1)甘氨酸几乎占总氨基酸残基的三分之一，即每9隔两个其他氨基酸残基(X,Y)即有一个甘氨酸，故其肽链可用(甘-X-Y)n来表示。2)含有较多在其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基，也有较多脯氨酸(pro)和赖氨酸。如脯氨酸(pro)和4-羟脯氨酸(4-hydroxyproline,Hyp)含量高达15-30%。同时还含有少量3-羟脯氨酸(3-hydroxyproline)和5-羟赖氨酸(5-hydroxylysine,hyl)。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定教员蛋白分子。例如，正常胶原在39变性，而在缺乏脯氨酸的羟化酶条件下合成的胶原在24变性成为白明胶(gelatin)。而羟赖氨酸上可结合半乳糖-葡萄糖苷，与特定组织功能相关。如在基底膜胶原(IV型)中含hyl较多，含糖也较多，可能与基底膜的虑过功能有关。3)胶原中缺乏色氨酸，所以它在营养上为不完全蛋白质。在胶原纤维中，胶原蛋白分子单位称为原胶原(tropocollagen)。每个原胶原分子由三条a-肽链组成，a-肽链自身为a螺旋结构，三条a-肽链则以平行、右手螺旋形式绕成“草绳状”三股螺旋结构见图。肽链中每三个氨基酸残基中就有一个要经过此三股螺旋中央区，而在此处空间十分狭窄，只有甘氨酸适合此位置，由此可以解释其氨基酸组成中每隔两个氨基酸残基出现一个甘氨酸的特点。而且三条a-肽链是交错排列的，因而使三条a-肽链中的Gly、x、y残基位于同一水平上，借Gly中的N-H基与相邻链X残基上羟基形成牢固的氢键见下图，以稳定其分子结构。原纤维胶原蛋白原纤维胶原蛋白的三股螺旋结构己为X,线衍射图像所证实，是三条a链相互缠绕形成的右手超螺旋结构。螺距9.6nm，每圈每股含36个氨基酸残基即12个Gly,X,Y三联体。三股螺旋中，沿a链每第三个氨基酸残基位于螺旋中心，其空间大小仅能容纳分子量最小的氨基酸即甘氨酸。形成三股螺旋结构还需:？有足够的羟脯氨酸；？C，前肽链间二硫键的形成。每条a链至少要有100个Y位羟脯氨酸残基才能形成稳定的三股螺旋。脯氨酸和羟脯氨酸的五环结构使胶原蛋白具有刚性。加强三股螺旋稳定性的还有分子内交联等化学键。a链的端肽形成胶原蛋白的球状结构区。下图胶原的右手超螺旋结构为胶原的右手超螺旋结构原纤维胶原蛋白分子直径15nm，长度300nm，分子量约为300kDa。II、III型胶原蛋白由三条相同的a链构成，为同三聚体(homotrimer),其余为异三聚体(heterotrimer)，a链的组成方式分别为；，a1(I),2a2(I)、a1(V)a2(V)a3(V)、a1(XI)a2(XI)a3(XI)。[a1(I)]3、，a1(V),3、，a1(V),2a2(V)也少量地存在于细胞培养液和胚胎组织。a链Gly,X,Y重复序列的连续性是原纤维胶原蛋白区别于非原纤维胶原蛋白的重要10特怔，也是形成高度有序的胶原原纤维的基础。Gly代表甘氨酸，X常为脯氨酸，Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸。因此，原纤维胶原蛋白的氨基酸中，甘氨酸约占1,3，脯氨酸和羟脯氨酸占1,5以上，还有大量的羟赖氨酸和丙氨酸。除III型胶原外，Gly,X,Y序列中均不含半胱氨酸。原纤维胶原蛋白的a链约有330个Gly,X,Y重复序列。a链的极性氨基酸和非极性氨基酸相间排列成极性区和非极性区，总之，原纤维胶原蛋白的一级结构十分规则。编码a链螺旋区的DNA高度保守，外显子的碱基对数目都是54的整倍数或是这种外显子的重组，生物进化过程中，从海胆起，编码胶原的基因就非常相似，提示各型原纤维胶原蛋白有共同的基因起源。a链呈左手螺旋，每圈有33个氨基酸残基，螺距为0.87nm。各型原纤维胶原蛋白的a链基本相似，a(V)、a(V)、a(XI)、a(XI)之间具有高度1312的同源性，a(XI)和a(lI)是同一基因的产物，a(XI)的糖化程度更高。编码a(II)1313的外显子有两种拼接方式，分别合成IIA和IIB胶原蛋白°a(IIA)的氨基端比a(lIB)11多69个氨基酸残基，分布于软骨膜、椎间盘髓核等非软骨组织。胶原原纤维原纤维胶原蛋白首尾相接，平行排列，聚合成胶原原纤维。由于a链的氨基酸交替出现极性区和非极性区，以头尾极性较大，相互平行的胶原蛋白纵向错开1/4分子长度(约70nm)，以相邻分子的极性区和非极性区的静电引力彼此聚合，首尾相接的胶原蛋白又保持一定距高，这样形成了胶原原纤维的疏区和密区，用醋酸铀或磷钨酸染色时，重金属沉积于疏区，透射电镜观察可见胶原原纤维呈现64,70nm的周期性横纹。由于极性区和非极性区的规律性分布，每周期内又出现几条明暗相同的横纹。原纤维胶原蛋白再以分子间交联形成稳定的胶原原纤维，交联形式以醛胺缩合为主。胶原原纤维是原纤维胶原蛋白自我装配形成的超分子结构。原纤维胶原蛋白聚合的程度及快慢，亦即胶原原纤维的粗细因胶原类型而异，也因组织器官、年龄等不同而异，差别很大，直径在20,200nm之间。最细的只有几个nm，由5个原纤维胶原蛋白分子构成。原纤维胶原蛋白的聚合受C-前胶原，N,前胶原等中间产物的调控。C,前胶原和N,前胶原即切去了N,前肽或C,前肽的前胶原。原胶原分子平行排列成束，通过共价交联，可形成稳定的胶原微纤维(microfibril),进一步聚集成束，形成胶原纤维。胶原分子内通过分子内或分子间的交联成为不溶性的纤维。因胶原分子氨基酸形成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋白那样以二硫键相连，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联，一般发生在胶原分子的C-或者N-末端之间。胶原样多聚体三螺旋轴的c端投影图胶原纤维在不同组织中的排列方式与其功能相关。如在肌腱、皮肤及软骨，要分别在一维、二维和三维方向承受张力，因而其胶原纤维排列分别为平行束状，多角的纤维片层及不规则排列等方式。若干胶原原纤维借蛋白多糖、糖蛋白等粘合质联结成小束，继而由小束集合成直径l,2um的胶原纤维。胶原原纤维也可以直接聚合成胶原纤维。由于胶原蛋白和a-链的螺旋方向刚好相反，胶原蛋白又是首尾相接，平行聚合，胶原纤维在偏振光显微镜下呈双折射现象(birefringence)。各型胶原蛋白形成的胶原纤维粗细不等，在偏振光显微镜下还显示不同的颜色，由此可对胶原蛋白的类型作粗略的估计，如I型胶原纤维呈黄色或红色,111型胶原纤维呈绿色。I、III、V型胶原分布广泛而且往往共存于同一组织，III型胶原在弹性较大的组织如血管和皮肤分布较多，而肌键和骨则以I型胶原为主°II型和XI型胶原特异性地分布于软骨和玻璃体。IV型胶原(COLIV)是基膜的主要成分。基膜不但可维持组织构型，而且可调节上皮细胞和细胞基质间的相互作用。目前发现许多疾病与基膜的结构和代谢缺陷相关，COLIV属三股螺旋蛋白家族，含大量的羟脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸，几乎不含芳香簇氨基酸，所以其抗原性较弱。其中许多涉及COLIV，如肾脏病，肝、肺纤维化及糖尿病等。尤其是纤维化疾病，COLIV的含量与结缔组织的增生程度呈正相关。IV.C是基底膜的主要组成部分(与体内其它纤维性胶原不同，它至少由二个不同的链组成，即a(IV)和a(IV)。21其主三螺旋约330nm长，氨基端三螺旋约30nm长，而羧基端为球状的非胶原结构区(分于呈丝状，头、尾分别相连形成网状结构其中四个氨基末端以二硫键相连构成四聚体(PIVNP)称为7S,而二个羧基末端的球体互相吸引形成二聚体(PIVCP)称为NCI。根据原胶原分子a肽链的构成、氨基酸组成和立体结构的不同，可将胶原分子分为约15种类型［25］。在超微结构上I,III型胶原有周期性横纹，横纹间距在52,62nm，而其它型胶原则为细丝状，无明显周期性横纹。在电镜观察中，常在一些病变组织中和某些肿瘤间质中及瘤细胞胞质内见到一种明暗横纹间隔大于62nm的胶原纤维，由于其横纹间隔大于正常胶原的横纹间隔（52,62nm）,因此称它为长间距胶原（LSC）。有关LSC的超微结构特征国外己有报道，1960年Luse在雪旺细胞瘤间质电见到一种间距在100nm,150nm且聚集成梭形的胶原小体。称为Luse小体。Dingemans把长间距胶原分为两种类型，致密型和疏散型。致密型含蛋白多糖，疏散型则不含蛋白多糖。但他们仅报道2型，乐美兆等经电镜观察和免疫组化染色，对17例恶性肿瘤，11例良性雪旺细胞瘤和2例椎间盘脱出症的髓核进行研究，根据它们的超微结构特征，将LSC分为3型，即小体型、疏散型和单股型。小体型和疏散型可见于神经鞘瘤的间质中，也可见于腹壁侵袭性纤维瘤病，恶性横纹肌样瘤和滑膜肉瘤的间质中和瘤细胞胞质中，而单股型仅见于1例椎间盘脱出的髓核中。小体型LSC是由长间距胶原纤维聚集而成的梭形小体，纤维排列致密，周期性明暗横纹间隔在90,160nm，暗带明显，排列有序，平直。小体周缘界清，此型LSC可见于神经鞘瘤的间质中，也见于腹壁侵袭性纤维瘤病，恶性横纹肌样瘤和滑膜肉瘤的间质中和瘤细胞胞质中（图l,3）。疏散型LSC不形成特定的梭形小体，胶原细丝排列疏松，暗带电子密度低，常呈波浪状，不规则，横纹间隔距离与小体型基本相同，周界不清，此型可与小体型LSC同时存在于间质中和瘤细胞胞质内，也可单独存在（图4）。23单股型LSC不同于上述两型，既不形成梭形小体，也不汇集在一起，而是呈单股状随意分布于无定形的或纤维性基质中，它的形态类似于I,III型胶原纤维，但它的周期性间隔超过I,III型胶原，它的平均间距为70,100nm.（图5）。目前仅见于椎间盘脱出症的髓核中，并不存在细胞质内。有关长间距胶原的性质主要有两种观点：(1)大部分LSC为VI型胶原(2)LSC是胶原纤维裂解时的中间阶段。Dingemens等为明确长间距胶原的性质，应用抗1,111型胶原抗12体，经免疫电镜标记，未发现这些抗体与LSC反应。因此，他认为LSC是胶原纤维裂解时的中间阶段。我们对瘤细胞内见到小体型和疏散型LSC的1例横纹肌样瘤和1例侵袭性纤维瘤病进行免疫组化染色，发现这些瘤细胞Vimentin阳性，Myoglobin阴性，说明这些瘤[26]细胞并非肌源性，而可能是间叶性。结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白.(FACIT)FACIT子结构可分为三个区:一区与胶原原纤维结合;二区刚性较好，是支撑一区的功能臂;三区借二区伸出胶原原纤维与细胞或细胞外间质的其他成分结合。其中一区，特别是COL1的氨基酸序列相对比较保守，在NO1与COL1交接处都有Cys,(Xaa)4,Cys序列(Cys代表半胱氨酸)，形成链内或链间二硫键。三区变异最大，与各型胶原的特殊功能有关。FACIT胶原的另一特点是。链两端的非胶原区在细胞外不被蛋白酶水解、FACIT不形成胶原原纤维，而是位于其表面，作为胶原原纤维与其他结构相互作用的中介，IX型胶原和XII、XIV型胶原分别与II型和I型胶原形成的胶原原纤维结合，XVI、XIX型胶原的倩况尚不明确，其中IX型胶原发现较早，研究较多。IX型胶原NC4)和胶原区IX型胶原有三条不同的a链，属异三聚体、a链的非胶原区(NC1,(C0L1,C0L3)依次沿羧基端向氨基端方向交替排列。由于存在可变启动子(alternativepromoter)，软骨的a(IX)NC4有243个氨基酸残基，呈碱性，可与富含阴离了的糖胺1而在角膜初级基质和玻璃体只有2个氨基酸残基、此外，a(IX)NC3比a(IX)多糖结合,21NC3多出5个氨基酸残基，序列为缬氨酸，谷氨酸,甘氨酸，络氨酸,丙氨酸，能与硫酸软骨素或硫酸皮肤素结合。因此，IX型胶原也是一种蛋白多糖，其侧链在软骨内较短，在鸟类的玻璃体则很长。IX型胶原的三条a链均以COL2的氨基端与a(II)的N,端肽形成共价交联，交联形式为吡啶或羟基吡啶(hydroxypyridinium)，a(IX)C0L2还与a(II)C,端肽结合。31COL3和NC4伸出胶原原纤维，与细胞外间质中的糖胺多糖结合，使细胞外间质具有整体性和稳定性，使软骨能较好地承受外部挤压和内部膨胀所产生的应力。XII和XIV型胶原XII型胶原为同三聚体，有XIIA和XIIB两亚型。a链包括COL1,COL2和NC1,NC3，NC3很长。XII型胶原蛋白的分子构型包括三部分：中NC1,COL2形成长75nm卷曲的尾，由NC3形成的球形中心及三个末端有小型球状结构，长度为80nm(XIIA)或60nm(XIIB)的指状结构°a(XII)COLl与a(XII)与a(IX)COL1氨基酸残基数目相111近，氨基酸和核苷酸序列都有50,相同，羧基末端都有一个半胱氨酸残基，两个非Gly,X,Y序列的位置相似，二者具有部分同源性°a(XII)NC3中的213个氨基酸残基也有134,相同，都有4个半胱氨酸残基处于相似的位置，因此也有一定的同源性。XIV型胶原的结构与XIIA型胶原极为相似。两种胶原的分布有组织特异性，在皮肤，XII型胶原以XIIB为主，分布于网状层和血管周围;XIV型胶原分布于乳头层、软骨内，XII型胶原以XIIA为主，局限分布于关节面、软骨管周围、关节面、软骨膜及软骨膜下层；XIV型胶原的分布则较为广泛。两种胶原的分布在胚胎发育时期都存在动态变化。与IX型胶原不同，XII型和XIV型胶原与胶原纤雉的结合缺乏共价交联，主要由氢键和二硫键完成、软骨内的XIIA型和XIV型胶原还结合有硫酸软骨素，结合部位在XII型胶原为NC3,,,14在XIV型胶原可能是NC1或NC2。XIV和XIX型胶原XIV和XIX型胶原发现较晚，和原纤维胶原蛋白的关系还不清楚，结构上与IX、13XII、X、IV型胶原都有不同程度的相似性。NC1和COL1的邻接区含有Cys,(Xaa)4,Cys序列而归入FACIT类、a(XIV)有10个胶原区，a(XIX)有5个胶原区°a(XIX)111NC11和a(XIX)NC6较长，成为胶原纤维与细胞外间质其他成分相互作用的桥梁。1IV、VIII和X型胶原IV型胶原是基膜所特有的结构蛋白，VIII型胶原仅存在于分隔角膜内皮和基质的角膜后界层即Descemen's膜，X型胶原特异性地由软骨内成骨时期的肥大性软骨细胞(hypertrophicchondrocyte)合成，分子结构与VIII型胶原极其相似，因此划为一类。(1)IV型胶原迄今己发现IV型胶原有6种a链，，a(IV),a(IV)是主要的结构形式。a122链由NC1、C0L1、NC2三部分组成，COL1很长，有1400多个氨基酸残基，包括20余个含2,24个氨基酸残基的非Gly,X,Y序列°IV型胶原蛋白全长400nm，NC2和部分COL1组成长度为30nm的7S区，含有半胱氨酸和赖氨酸，NC1也富含半胱氨酸。通过二硫键和共价交联作用，胶原蛋白单体经NC1聚合成为二聚体，再经7S聚合形成四聚体，四聚体最后形成立体网络结构，容纳层粘连蛋白，巢蛋白复合物(laminin,nidogencomplex)和硫酸肝素蛋白多糖等基膜成分，使基膜具有机械和化学的屏障功能。IV型胶原广泛分布于细胞外间质，是由三条a链构成的异三聚体、a链中NCI,COL1,NC2组成。COL1很短，含2个非Gly,X,Y序列。NC1和NC2较长，以a(IV)NC23最长，有18O4个氨基酸残基°IV型胶原单体反向聚合成为二聚体，单体间重叠75nm为内区(innerregion)，有NC1形成的大型球状结构，两侧30nm为外区(outerregion)，包括部分COL1和NC2形成的小型球状结构。两个二聚体再度平行聚合形成四聚体。最后，四聚体首尾相接外区之间部分重叠，形成周期为100nm的微原纤维(microfibril)，内区的大型球状结构使微原纤维呈串珠状、微原纤维进一步聚合形成胶原纤维。IV型胶原结构特点为:？COL1有识别整合素的RGD序列。？COL1形成N,糖苷键必需的天冬酰胺,X,丝氨酸，苏氨酸序列。？NC1、NC2含有vonWillebrand因子(vWF)A型序列。？a(VI)NC13含有与纤连蛋白和腱生蛋白(tenascin)、Kunitz型蛋白酶抑制剂、涎蛋白相似的氨基酸序列。？能结合核心蛋白聚糖(decorin)和hyaluronan。(2)VIII和X型胶原本组胶原蛋白的a链最短，分子量只有60kDa左右，包括NC1、COL1和NC2。X型胶原为同三聚体，VIII型胶原的分了结构可能是[a(VIII)]a(VIII)。三条a链，尤其是122NC1和COL1的基因结构、氨基酸序列都极其相似。两种胶原蛋白单体梭基端(NC1)聚合成多聚体，多聚体在氨基端(COL1，NC2)结合，形成六角形网格结构。VIII型胶原分布于角膜后界层，X型胶原与钙的亲和力较高，短期地存在于软骨内成骨过程的肥大区(hypertrophiczone)，随骨化而消失，说明它参与了软骨的钙化作用。VII型胶原首先发现它是固着原纤维的主要成分，对表皮起连接和支持作用井与大疱性表皮松解症的发生有关。VII型胶原为同三聚体，a链中氨基端向羧基端包括NCl(150kDa)、C0Ll(170kDa)和NC2(32或34kDa)三部分。COL1有1530个氨基酸残基，长达424nm，其次是NC1,有1245个氨基酸残基，包括1个软骨基质蛋白(cartilagematrixproteinCMP)序列，9个连续的纤连蛋白III型序列和1个vWFA型序列。胶原蛋白单体中NC1形成顶端有球状结构的三条臂、单体间经NC2相互聚合形成二聚体，许多二聚体聚合就形成了固着原纤维。固着原纤维呈袢状缠绕I、III型胶原纤维，两端分别附着于真皮，表皮连接(dermo14‘epidermaljunction)的致密板和位于真皮乳头层，主要中IV型胶原组成的固着张斑(anchoringplaque)并与半桥粒发生联系。除皮肤外，VII型胶原及固着原纤维还存在于消化道等其他器官的上皮组织，参与细胞的分化、粘附和基底膜的滤过等功能。XIII和XVII型胶原二者并不同源性，但两者有相同的结构特征:?氨基端有跨膜区而无信号肽。?外显子发生可变拼接(alternativesplicing)使其a链包括胶原区在内呈现结构的多样化。a1(XIII)肽链很短，包括3个胶原区和4个非胶原区，COL1、COL2、NC2和NC4的氨基酸残基数目因可变拼接变化较大。胶原的产生以间充质来源的细胞为主，分布广泛，从胚胎到成人的多种组织都有mRNA表达。XVII型胶原最初发现于表皮的个桥粒，是大疱性类天疱疮等疾病的自身抗原，a链有13个胶原区和14个非胶原区，氨基酸总数为1433。两种胶原的结构和功能还须进一步研究。XV和XVIII型胶原XV和XVIII型胶原的发现较晚，同源性较高。二者还有下列共同点:？胶原区很多，分别为9个和10个、?分了两端都是大型球状结构、?糖胺多糖和寡糖结合位点多。？分布广泛，以内脏器官较多。XVIII型胶原的基因有两个可变启动子，其中一个启动子的转录产物中编码NCl的外显子发生可变拼接，因此XVIII型胶原还有不同的亚类。组织中还存在由不同类型胶原聚合而成的异型原纤维（heterotypicfibril，己发现I型胶原与III、V、XII、XIV型胶原都可形成异型原纤维°II型胶原则与IX型和XI型胶原聚合成异型原纤维，其中XI型胶原形成原纤维的核心，IX型胶原位于表面，II型胶原是原纤维的主要成分。构成异型原纤维的胶原蛋白还参与调节胶原原纤维的直径大小。四、胶原提取物的分子量测量胶原提取物的分子量测量的常用方法（1）,,,（十二烷基磺酸钠）凝胶电泳法蛋白质分子量测定较多用的是,,,（十二烷基磺酸钠）凝胶电泳法,这种方法最适宜的测定分子量是15000,100000的样品,对低于10000分子量的水解蛋白不太适用。通过改进,用强电解质离子为前导离子和拖尾离子,可对分子量低于10000的水解蛋白样品进行分子量测定。用,,,凝胶电泳法测定蛋白质分子量的理论依据蛋白质分子中同时含有羧基和氨基,羧基可给出氢离子,+,氨基可接受,+,故蛋白质具有两性性质。蛋白质中的羧基和氨基可互相作用形成双极离子。在,+浓度大的溶液中蛋白质以正离子存在;而在,,-浓度大的溶液中蛋白质以负离子形式存在。若溶液的,,值为某一数值时蛋白质以中性的双极离子形式存在,这个,,值称为蛋白质的等电点。等电点时因蛋白质分子整体不带电,所以在电场中不会移动。带电蛋白质分子在电场作用下将作定向移动,其移动的速度，可表示为：，二，？6n,n,?为分子（或离子）所带净余电荷,，为两电极间电位差,，为两电极间距离,，为球形分子的半径，n为溶液的粘度。从上述表示式可知,在其他条件（电场、介质粘度等）不变情况下,蛋白质在凝胶中的迁移速率受分子所带净电荷量与分子大小两个因素的影响。如果两种不同分子量的蛋白质的分子大小的差异被所带净电荷量的差异所补偿时,则这两种不同分子量的蛋白质可以相同的速率电泳,这将无法通过电泳距离测定蛋白质的分子量。为了解决这一问题,人们经过长期的研究发现,在,,,（十二烷基磺酸钠）存在下蛋白质的电泳速率和它们的分子量的对数成直线关系。其理由是,,,能与蛋白质的疏水区相结合并把绝大部分蛋白质分离成它们的组成亚单位。,,,的结合还使变性的、随机盘曲的多肽链得到大量负电15荷,这种负电荷基本上掩盖了无,,,存在时正常带有的任何电荷,就是说,使不同大小分子量的蛋白质都带上基本相同的电荷,所以使得蛋白质分子的电泳速率和分子量的大小有了一定的关系:分子量大,泳动迁移率小;分子量小,迁移率大,具体为上述,,,—,直线关系。在用,,,凝胶电泳法测定蛋白质的分子量时需同时至少用3,4种标准蛋白质,这几种蛋白质的分子量有的应高于待测蛋白质,有的应低于待测蛋白质,使待测蛋白质夹在标准蛋白质中间,从标准蛋白质得到的直线上就能找到待测蛋白质的适当位置,从而确定其分子量。实际进行电泳时的电泳槽有圆盘电泳槽和板型电泳槽。我们选用板型凝胶电泳槽,此种电泳槽的优点是便于对多种实验样品进行比较,因为所有的样品都存在于同一凝胶中,各样品的电泳条件是完全一致的。另外,操作起来简便,易于进行染色、脱色等泳后过程。（2）SDS,PAGE（SodiumDodecylSulfate,PolyacrylamideGelsElectrophoresis,十二烷基硫酸钠，聚丙烯酰胺凝胶电泳）法1967年Shapiro提出用SDS,PAGE法测定蛋白质的分子量。Bell研究了一种从蛋白质混合物中辨别出胶原蛋白的SDS,PAGE分析方认，这对胶原类蛋白质的鉴定及其特性分析极为重要。Yoshihiro改变了SDS,PAGE传统的染色方法，对胶原蛋白进行了结构分析。其他学者在SDS—PAGE法分析人I型及III型胶原的结构组成方而作了大量工作，得到了I型和III型人胶原蛋白的标准曲线，并测定了组织中I型和III型胶原蛋白的组分含量。国内最早进行胶原研究工作之一的第二军医大学曾用SDS,PAGE法研究猪皮中提取的胶原蛋白的分子量，虽没有得到胶原蛋白准确的分子量，并与人体血清蛋白进行了比较。(3),,,-,,,(十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳)法十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳(,,,-,,,)是近年发展起来的一门新技术。和,,,-聚丙烯酰胺凝胶电泳(,,,-,,,,)相比,它具有微量、快速、定量准确、易自动化等特点。在,,,-,,,中,高粘度交联胶(如交联聚丙烯酰胺胶)或低粘度非交联聚合物网络(如葡聚糖、聚环氧乙烷、支链淀粉)可被用作筛分介质。廖海明、杨昭鹏等:以葡聚糖为分离介质,线性聚丙烯酰胺涂渍毛细管柱为支持介质,柱上214,,检测,进行蛋白质分离。结果:被分离的蛋白质分子量的对数与其相对迁移率之间具有良好的线性关系(,=0997);涂渍毛细管柱可以使用多达100次而未出现分离效率的降低;同一毛细管柱和不同毛细管柱迁移时间的,,,分别小于10%和13%;用十二烷基硫酸钠-毛细管胶电泳(,,,-,,,)方法测定的15种蛋白质的分子量与用平板,,,-聚丙烯酰胺胶电泳(,,,-,,,,)测定的分子量具有良好的一致性。结论:毛细管电泳法可用于蛋白质分子的分子量测定,它具有准确、快速等优点。(4)激光微探针飞行时间质谱仪和基体帮助激光解吸质谱(MALDI)法传统的测定分子量及纯度的方法,是应用,,,聚丙烯酰胺凝胶电脉及高效液相色谱仅能给出表观分子量,这些方法不仅受多种实验条件所限而且误差相当大,灵敏度也差,样品用量大,且操作十分复杂,往往难以得到令人满意的结果。,,,,， ,,,,,法在测定生物大分子分子量方面已成为一种强有力的分析手段,是常规测定大分子分子量方法所无法比拟的。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是80年代末发展起来的一个最新的质谱学分支，特别是对生物大分子的分析方面有了重大突破。传统的测定分子量及纯度的方法是应用SDS,PAGE凝胶电泳及高效液相色谱，这些方法不仅受多种实验条件所限，而且误差大，灵敏度差，样品用量大，往往难以得到令人满意的结果。法元法比拟的。由于CaM具有相对较高的分子量，用传统测定蛋白分子量的方法以及常规的质谱难以对其进行测定与研究，季怡萍刘淑莹采用MALDI,toFMS法对CaM的纯度与分子量迸行了分析与研究。实验结果表明该方法具有灵敏度高、分析速度快、重复性好、信息直观等特点，是其它传统测定蛋白质分子量的方季怡萍刘淑莹用,,,,， ,,,,,法快速测定天花粉蛋白分子量。仪器为,,，1700激光解吸电离飞行时间质谱仪(美国,,,,16,,,;,,,,,,,;，,;),2激光器,激光波长337,,,质谱信号为单次扫描累加,4加速电压为30,,,吸引电压9.3,,,检测电压-4.75,,,真空度为1.3X10,,，以正离子谱测定。基质由美国,,,,,,,;,,,,,,,;公司提供:(1)100,,,,/,芥子酸(,,);(2)100,,,,/,2,5二羟基苯甲酸(,，，)；(3)30,,,,/,a氰基4羟基肉桂酸(a,,,)。质量校正标样:，，，2503,蛋白标准样品。将,，，样品配成106,,,/，的水溶液吸取10口，置于小塑料管中，再加入10口，的基质(分别做三种不同的基质)混匀，取1U,此溶液滴于进样探头上，抽空除去溶剂,使样品/基质混合物在探头上形成均匀的结晶,直接插入质谱仪进行分析。从以上结果可见,,,,，,,,,,技术不仅可以有效地检测出,,,的准分子离子峰,还伴有双电荷峰及多聚体峰,而且分子离子峰最强,这一特征便于确认分子量。本实验对,,,进行了测定,得到了准确的分子量信息和纯度信息。实验证明该方法在蛋白质分子量、纯度和杂质测定中具有测量精度高、分析速度快、灵敏度高、分辨能力强、样品消耗少等优点,适用于研究初期测定产物的分子量、纯度和杂质情况,是测定稀少样品的经济方法,是其它传统的测定蛋白质分子量方法无法比拟的。此项工作为进一步研究,,,提供了重要信息。胶原蛋白分子量测量的常见错误样品量选择不当:这是最常见的错误。每一个样品电泳分离时,都应该对同一蛋白浓度的样品作不同样品量的梯度测定,尽可能使每一条蛋白带都呈现清楚。如果某一蛋白质含量过多,往往可在它的迁移位置上“溢出”,即向两端弥散,呈团块状。像这种情况就不应该以它的溢出范围来定分子量。一个样品可能有众多的蛋白成分,电泳后,绝大多数的蛋白带纹清晰可数,也可能仅有某一蛋白成分量过多,呈团块状,如分离血清蛋白时,白蛋白带往往见于此现象。这时若该蛋白质成分比较重要,必须精确测出其分子量的话,这时,可在旁边一孔中加入更少量的样品,使该一蛋白带达到清晰满意的程度。凝胶电泳时,选择,%和,%不当:这是操作者最易忽视的错误。因为,在凝胶电泳时,若选择的,%和,%不合适,则形成的凝胶分子筛的孔径会不一致,形成所谓有缺陷的分子筛。样品在其中电泳时,分辨率自然会降低,并可能会出现施尾现象。还应注意到不同的实验室,分离或分析同一种生物某一蛋白质时,由于不同实验室的试剂,其纯度、产家不同以及所使用的仪器规格、型号也不同,因此对他人成功的经验只能作为重要的参考依据,而不应完全照搬,应该结合自己实验室的情况摸索出最佳的实验条件。电泳方法选择不当:自从1964年,,,,,利用盘状电泳成功地分离了人血清以来,30多年中,该项技术已得到了迅速的发展。已由单一的盘状电泳方式发展到垂直板型、平板型、超薄膜型等;电泳材料和技术已有琼脂糖-,,,,、,,,-,,,,、等电聚焦电泳、梯度凝胶电泳、双向电泳、凝胶免疫电泳、凝胶电泳印迹技术等多项技术。如若从测定蛋白质分子量来说,一般认为单一浓度的凝胶电泳、梯度凝胶电泳、单一浓度,,,凝胶电泳、,,,-梯度凝胶电泳,它们的分辨率是递增的。作者可根据本实验室的条件、设备、技术掌握的成熟程度及实验目的考虑选用。如若用单一浓度的凝胶电泳分不开的蛋白质,可使用其它几种分辨率较高的凝胶电泳方法尝试。但应该注意到用,,,凝胶电泳系统,蛋白质分子已降解为亚基,将会影响到蛋白质的免疫活性,尤其是分析酶蛋白时,酶的活性丧失贻尽。这时可考虑改用等电聚焦电泳,它