乌头汤对大鼠肝药cpy3a4活性的影响

乌头汤对大鼠肝药cpy3a4活性的影响

cyp3a4是大多数p450酶之一，参与大约50%药物的生物转化。同时,CYP3A4酶的活性也被许多药物抑制或诱导,从而引起药物间的相互作用。因此,明确常用药物对CYP3A4活性的影响对预测药物间相互作用,提高药物合用的有效性和安全性具有重要意义。乌头汤为温经止痛法治疗寒湿痹证的经典方剂,临床常随证配伍中药或西药使用且收效良好。目前有关乌头汤的研究多从药效物质基础的角度开展,而从CYP介导的代谢性相互作用方面的研究尚未见报道。本实验选用大鼠肝微粒体混合酶体外代谢体系,以睾酮为探针,采用超高效液相色谱(UPLC)测定6β-羟基睾酮的生成量,计算其代谢速率并评价CPY3A4活性的变化,旨在探索乌头汤与CPY3A4底物药物合用时产生药物间相互作用的可能性。1材料表面1.1特芬材料麻黄、芍药、黄芪、制甘草、制川乌均购自北京华邈中药工程技术开发中心。1.2动物SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重180～220g,购自广州中医药大学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2008-0020。1.3还原型氧化酶抑制剂的合成睾酮、6-β羟基睾酮(nacalaitesque,纯度>98%),吉非贝齐(内标,Sigma-Aldrich,纯度>98%),乙腈(色谱纯,merck),solutionA,B(还原型辅酶ⅡA,B溶液,BDbiosciences),苯甲基磺酰氟化物(PMSF,Sigma-aldrich),二硫苏糖醇(DTT,Sigma-aldrich)。UPLC(Agilent),Elix超纯水系统(Milipore),BT25S型精密电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司),5810R型高速离心机(Eppendorf),CS150NX型超高速离心机(Hitachi),MS3digital型涡旋振荡器(IKA),pH计(MettlerToledo),酶标仪(BIO-RAD)。2方法2.1各组原方剂量及未剂量剂量对杂汤原方剂量的影响50只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、抑制剂SKF-525A组(0.1g·kg-1)、乌头汤高剂量组(原方剂量2倍)、乌头汤中剂量组(原方剂量)、乌头汤低剂量组(原方剂量1/2)。连续灌胃给药7d,空白对照组给予等量的水。2.2睾酮、6'基酮和jibeece内标的配置精密称取睾酮、6β-羟基睾酮、吉非贝齐适量,以乙腈溶解分别配置成12,6,10mol·L-1的储备液,-20℃保存备用。2.3匀浆、匀浆的制备大鼠连续诱导7d后,乌拉坦麻醉,用冰冷的肝脏冲洗液在体冲洗肝脏。洗净血液后的肝脏取出在4℃切碎,并用冰冷的匀浆缓冲液匀浆。匀浆液10400r·min-1离心15min;取上层35000r·min-1离心1h,得肝微粒体。所得肝微粒体用250mol·L-1蔗糖混悬均匀,-80℃保存备用。用考马斯亮蓝法测定肝微粒体总蛋白浓度。2.4-三醇解氨肝微粒体终止反应加入450μL磷酸盐缓冲溶液,25μLSolutionA,5μLSolutionB,10μL肝微粒体悬液,37℃,150r·min-1水浴摇床孵育5min,再加入睾酮(终浓度分别为4,10,30μmol·L-1)继续孵育(时间分别为7,7,15min)后,立即加入4mL冰冷二氯甲烷终止反应。2.5rmin-1离心取2.4项下终止代谢的样品,加入10μL吉非贝齐(内标),涡旋8min后1000r·min-1离心15min。取下层3.5mL于真空干燥箱中吹干。残渣加入100μL乙腈涡旋3min,再加入100μL双蒸水,涡旋3min,13000r·min-1离心30min,取上清10μL,UPLC进样分析,以6β-羟基睾酮的生成量计算代谢速率。2.6流动相a乙腈b的检测色谱系统:Agilent1290InfinityUPLCSystem,AgilentRRHDSB-C18色谱柱(3.0mm×100mm,1.8μm),柱温40℃,进样体积10μL,流速0.4mL·min-1,流动相A乙腈,流动相B水(0～2.5min,70%～10%B;2.5～4min,10%～50%B;4～5min,50%～70%流动相B,5～6min,70%流动相B。检测波长235nm,洗脱时间6min。UPLC图见图1。2.7统计处理实验数据用x¯±sx¯±s表示,采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。P<0.05为有统计学意义。3结果3.1线性关系检验以睾酮和6β-羟基睾酮浓度为横坐标(X),睾酮和6β-羟基睾酮峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得睾酮标准曲线Y=0.120X(R2=0.999);6β-羟基睾酮标准曲线Y=0.123X(R2=0.999)。结果表明睾酮在1.016～260μmol·L-1线性关系良好;6β-羟基睾酮在0.195～100μmol·L-1线性关系良好。3.2方法研究3.2.1批内rsd制备低、中、高3种浓度(0.5,10,90μmol·L-1)6β-羟基睾酮的空白孵育样品,每一浓度5个样本。按2.5方法处理后进样测定,以6β-羟基睾酮浓度求得值,计算批内RSD,结果分别为3.52%,0.97%,1.40%;另连续测定3d,计算批间RSD,结果分别为9.08%,2.04%,0.20%。表明本法精密度良好。3.2.2-羟基睾丸酮的gsd制备低、中、高3种浓度(0.5,10,90μmol·L-1)6β-羟基睾酮的空白孵育样品;低、中、高3种浓度(5,40,250μmol·L-1)睾酮的空白孵育样品,每一浓度5个样本。于37℃水浴摇床中孵育0,1,4h后,按2.5项方法处理进样测定。以睾酮与内标峰面积之比均值计算RSD,结果4h时RSD分别为7.50%,6.15%,8.50%。同法计算得6β-羟基睾酮4h时RSD分别为5.00%,6.51%,6.37%。表明睾酮和6β-羟基睾酮在孵育体系中4h内稳定。3.2.3浓度5个样本制备低、中、高3种浓度(0.5,10,90μmol·L-1)6β-羟基睾酮的空白孵育样品,每一浓度5个样本。按2.5方法处理后进样测定,以测得的6β-羟基睾酮峰面积,与对应的对照品溶液比较,获得6-羟基睾酮提取回收率。结果平均回收率分别为93.86%±2.46%,93.92%±4.44/%,87.85%±0.78/%,RSD分别为2.62%,4.73%,0.89%。3.3cyp3a4酶代谢活性的检测与空白对照组相比,乌头汤各剂量组的睾酮代谢速率均明显降低(P<0.05)。结果见表1。4不同中药对cyp3a4代谢活性的影响乌头汤始见于《金匮要略》,是治疗风寒湿痹的代表方。研究表明乌头汤对类风湿性关节炎有较好疗效,且临床常随证配伍中药或西药应用。罗试计报道了乌头汤和甲氨喋呤、塞来昔布联合使用治疗类风湿性关节炎的疗效显著优于单用西药组。毛接红发现与单用西药氟米特相比,同时服用乌头汤加味桂枝、干姜等能更加显著地改善风湿痹证者的临床症状。然而,近年来一些常用中药和西药合用后也常常发生药物相互作用而产生毒副作用或不良反应,如当抗凝药华法林和银杏、大蒜、当归、丹参合用时导致严重出血等。因此,研究常见中药及其复方对肝药酶CYP3A4的影响,可为临床上防止药物间相互作用提供依据。本实验通过考察乌头汤对CYP3A4代谢活性的影响,发现与空白对照组相比,乌头汤高、中、低剂量组的睾酮代谢速率均明显降低;与乌头汤低、中剂量组相比,乌头汤大剂量组的睾酮代谢速率皆降低,说明乌头汤连续给药7d后可明显抑制大鼠肝脏CPY3A4代谢活性。乌头汤中君药为制川乌,其治疗剂量与中毒剂量很接近,用药不慎易产生毒副作用,导致严重的心律失常与休克甚至中毒死亡。而且,笔者研究发现乌头中的主要毒性成分和药效成分乌头碱在体内主要经CYP3A4代谢。提示了乌头汤虽为经典方剂,临床应用广泛,但当其与CYP3A4底物药物联合使用时,可能发生药物间的相互作用,干扰乌头碱或其他成分的正常代谢,导致毒副作用或不良反应的产生。目前,探针药物已广泛用于不同个体CYP450表型和活性的研究。选择目标代谢酶的特征代谢产物作为探针药,通过高效液相色谱(HPLC)法或者HPLC-质谱(MS)方法定量检测代谢产物的量,来反应酶的活性。睾酮是在体外试验中检测CYP3A4/5酶活性的首选化学底物。在