血细胞体外融合法八

医学细胞生物学细胞与分子生物学教学实验室王保国505房间776533分机实验安排9月27日1~3节细胞融合(牛蛙血细胞)10月11日1~3节染色体制备(小鼠骨髓细胞)10月18日1~3节看录像，实验考查细胞融合——牛蛙红细胞的体外融合

了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。通过PEG诱导牛蛙血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。熟悉用血细胞计数板计数细胞。目的要求同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。细胞融合（cellfusion）又称体细胞杂交（cellhybridization），是指将不同来源的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂交细胞（hybridcell），此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。常用方法：生物方法、化学方法、物理方法。概念细胞融合的原理膜结构：脂质双分子层，流动镶嵌模型细胞膜的流动性：环境因素等诱导因素使细胞膜的脂类分子的有序排列改变

融合过程中两个细胞膜的变化过程

类脂质分子发生疏散和重排导致细胞桥的形成细胞质、核相互融合显微镜下的细胞融合过程

PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体，具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。

PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。使用方便，但有一定毒性，有些细胞不适用。实验原理(化学法)聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程融合过程两细胞（或多细胞）的接触、粘连。两细胞（或多细胞）的细胞质连通。通道扩大，两细胞（或多细胞）连成一体。细胞完全合并，形成一个含有两个（或多个）核的细胞。注意区分细胞融合和细胞重叠。牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬液放入离心管→加入4mlHanks液混匀→1000rpm/min离心5min→弃去上清液，轻弹离心管混匀细胞PEG诱导细胞融合：吸取0.5ml37℃的50%PEG溶液，在37℃水浴中慢慢沿着离心管壁逐滴加入10滴，边滴边摇→在37℃水浴中静置2min终止PEG作用：缓慢加入5mlHanks液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min制备细胞悬液：用吸管混匀，1000rpm/min离心5min→弃去上清液，加入Hanks液2.5ml

，再混匀、离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀细胞方法与步骤（融合）染色和镜检：载玻片上加１滴细胞悬液和１滴詹纳斯绿染液混匀，染色3min→盖上盖玻片后镜检（观察两个高倍视野细胞融合情况）

细胞融合率：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。融合的细胞核总数/所有细胞核总数×100%方法与步骤牛蛙血细胞的获得：心脏采血、肝素抗凝牛蛙血细胞储备液的制备：加4倍体积的0.85%NaCl溶液，4℃保存牛蛙血细胞悬液的制备：1ml储备液加5ml0.85%NaCl溶液离心洗涤(1200转5分钟)2次，弃上清液，加入10mlGKN溶液混匀制成细胞悬液计数：牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬液加入4mlHanks液混匀，取10μl加入计数板计数（2个或4个大方格）。

原则：压线的细胞数上不数下，数左不数右血细胞悬液制备及计数细胞计数板注意事项每个吸取细胞悬液的步骤，均要注意混匀细胞且要轻柔。必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1~2分钟。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高细胞的融合率。计数板充液应一次充完，避免产生气泡，静置1~2分钟后计数。注意区别血细胞计数板的血盖片与一般的盖玻片，计数板、血盖片用清水冲洗后，擦干收回。发展历史Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生合并的现象。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。真正意义上的细胞工程诞生了。细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。细胞融合的方法

生物法

、化学法及物理法。原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性——随机结合、融合1、生物因素：仙台病毒

研究最早的促融剂。毒性大而使应用受到限制。仙台病毒（HVJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HVJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。活性与其被膜的磷脂成分有关：糖蛋白、神经氨酸酶的突起原理与过程灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37℃下1-2分钟），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。3、物理法——电融合诱导法

在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。融合方法选择具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法；微生物细胞融合只适用PEG法。细胞浓度(个/ml)=４个大方格内的细胞总数/4×10×103×稀释倍数细胞融合率(%)=两个视野中融合的细胞数/两个视野中的细胞总数×100%作业思考题预习：实验27制备小鼠染色体之前如何处理小鼠，为什么？对比小鼠骨髓细胞与人体外周血白细胞染色体制备的异同点。P50：1、2显微镜的使用及细胞形态观察光学显微镜基本结构照明灯粗细调节推进器聚光器接口载物台切片夹物镜目镜色差矫正（复消色差）数值孔径1.40观察的介质油镜工作距离0.21mm放大倍率指示色带蓝色—60倍弹簧物镜保护装置

生产厂家

平场矫正

放大倍率

特殊观察方式

筒长（无限远系统）

盖玻片厚度

(0.17mm)放大倍率指示色带：红色—4X黄色—10X绿色—20X浅蓝色—40X蓝色—60X白色—100X物镜的符号

用右手握住镜臂，左手托镜座，从镜箱内取出显微镜，把显微镜放在身前稍左侧的实验桌上，镜臂对着胸前使镜筒向前方。镜座与桌边距离约为6.66cm（2寸）适当高度的凳子进行操作。

显微镜的使用方法

·先向上转动粗调节器，使镜筒上升，再转动旋转盘，使低倍镜对准通光孔，即能听到“卡扣”的固定响声，同时手也感到有阻力，说明物镜与镜筒已经成一直线。

·对光：打开光圈,旋转聚光器升降螺旋，使聚光器升到和镜台平齐。用左眼在目镜上观察（两眼齐睁），同时用反光镜的凹面对向光源取光,要求视野的密度完全均匀。

·装置玻片标本：将标本片有盖玻片的一面向上置于载物台上，玻片两端用弹簧夹夹住，然后移动玻片，使标本对准镜台孔。

·调焦：从侧面观察低倍镜，转动粗调节器，使镜筒下降，当低倍镜距标本约0.5cm时，用左眼从目镜上观察，慢慢向上转动粗调节器，镜筒也随而上升,直至视野出现清晰物象为止。如物象不在视野中央，可移动玻片标本的位置，注意玻片移动方向与物象移动方向恰好相反。低倍镜的使用使用高倍镜必须依照上述步骤先在低倍镜下找到物象后，然后把要放大的部分移到视野的中央，调节到最清晰的程度后，才能进行以下操作：转动旋转盘，使高倍镜与镜筒成一直线，转换高倍镜时速度要慢，特别当心高倍镜是否触碰到玻片，如碰到玻片证明低倍镜的焦距没有调好，应重新调节。调焦：用左眼从目镜观察，这时物象往往不甚清楚,可用细调节器慢慢向上或向下转动（切勿用粗调节器），转动范围不宜过大，一般只需向上或向下转动一圈,就能清晰地看到物象。需要更换玻片标本时，应先转动粗调节器使镜筒上升之后，才能取下玻片标本。高倍镜的使用1.拿显微镜时应右手紧握镜臂,左手托住镜座,防止目镜从镜筒滑出和反光镜脱落。2.显微镜用后，必须将目镜、物镜、反光镜等用清洁的擦镜纸或绸布擦拭,切勿口吹、手摸或用粗布揩擦,勿用乙醇及其他药物,以免侵蚀镜台或镜头。3.使用显微镜应先用低倍镜调节光源,如观察组织细胞或染色较浅标本时,要适当关小光圈,使物象清晰。4.放置玻片标本时,应注意标本的正反，把要观察的部分对准通光孔的正中央。如果标本放反,不仅找不到物象,并且容易压碎玻片,损伤物镜。5.观察时要两眼齐睁,用左眼从目镜中寻找物象,仔细观察,用右眼看纸绘图。粗、细调节器都不能做单方向的旋转，如一直上升粗调节器会使镜筒脱落。反之,如一直下降会压碎玻片。6.不要随意取出物镜以防灰尘落入。禁止任意拆卸零件，以防意外损失。

7.显微镜用完后,应转动粗调节器使镜筒徐徐上