解淀粉芽孢杆菌bgp14对胡萝卜软腐欧氏菌的分离鉴定及生物防控效果

解淀粉芽孢杆菌bgp14对胡萝卜软腐欧氏菌的分离鉴定及生物防控效果

芋头是天南星科的一种植物。地下茎中富含淀粉和各种微矿物。具有二者之药、食用之功效。它广泛种植于中国长江流域和南部，是人们喜爱的健康食品。每年10—11月份采收芋头块茎,进行贮藏,以便长期供应市场。在保藏过程中,由于芋头呼吸旺盛、湿度高、伤口多,容易引起病原菌的侵染,从而腐烂变质。其中,由胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora,Ecc)引起软腐病是导致贮藏期芋头腐烂变质的主要原因之一。目前,贮藏期芋头软腐病的防治主要依靠化学杀菌剂和抗生素,例如次氯酸盐、农用链霉素、代森铵等。近年来,随着人们食品安全意识的提高,化学杀菌剂和抗生素被严格限制或禁止在采后农产品上应用,这就促使研究者寻求更加安全的采后农产品病害防治替代技术。基于微生物的生物防控技术被认为是未来贮藏期农产品病害控制的主要发展方向之一,例如枯草芽孢杆菌、罗伦隐球酵母等。本实验拟从容易发生软腐病的环境中分离筛选对Ecc具有较高拮抗活性的生防菌株,评估其对贮藏期芋头软腐病的生防效果,初步分析其可能的作用模式。1材料和方法1.1平板培养平板样品分别来源于江苏省农业科学院蔬菜田表层土壤和新采收的芋头表面黏附土壤,每种样品随机收集200g,晾干、混匀。每种土壤样品取10g,分别加入到含有100mL灭菌水的250mL锥形瓶中,在200r/min、30℃的条件下孵育4h。利用蒸馏水梯度稀释,涂布2YT(胰蛋白胨17g/L、酵母提取物10g/L、NaCl5g/L,pH7.0)琼脂平板,将平板在30℃条件下培养16h。从平板上挑取单菌落,在2YT平板上划线纯化培养2次,将纯化后的单菌落划线保存在2YT平板上待用。1.2yt液体培养基将纯化的单菌落在2YT液体培养基中培养,培养条件为150r/min、30℃、36h,培养液备用。将病原菌Ecc(本研究室从贮藏期芋头上分离鉴定并保存)在2YT液体培养基中培养,培养条件为150r/min、30℃、12h。将培养好的Ecc菌液按照1%的体积比加入到液态的2YT琼脂培养基中(温度低于40℃),迅速混匀、倒平板。凝固后利用灭菌打孔器在每个平板上均匀打6个孔(直径为4mm),在每个孔内滴加待验证生防菌菌液40μL。将处理好的平板放置在30℃培养24h,然后调查每个菌株的拮抗圈直径,以未加生防菌菌液的孔作为空白对照组。每个菌株接种3个孔,相同的实验重复了3次。1.3人民群众的培养根据初筛的结果,选择拮抗圈直径大于10mm的菌株进行生防效果的活体评价。挑取具有较高拮抗活性的菌株在2YT液体培养基中培养,培养条件为30℃、150r/min、36h。取上述培养液40mL、10000r/min条件下离心30min,将上清液经0.22μm细菌过滤器过滤后备用。另外,挑取病原菌Ecc单菌落于2YT液体培养基中,在30℃、150r/min条件下培养12h,利用灭菌蒸馏水稀释50倍备用。实验用芋头是从江苏省靖江市购买的香沙芋,选择新鲜、大小基本一致、无损伤的健康香沙芋,利用次氯酸钠溶液(体积比0.1%的有效氯)浸泡1min,然后用自来水冲洗、晾干。将芋头的柄掰断1~2cm,产生新的创伤断面。将芋头的创伤断面分别浸没在拮抗菌发酵液或上清中10s,对照处理样品浸泡在清水中,在室温条件下风干2h。然后在每个断面接种Ecc菌液5μL。将处理好的芋头放置在塑料保鲜箱内,22℃条件下孵育,每天观察芋头的发病情况,于第10天调查芋头的发病率和腐烂情况。病斑面积大于0.2cm2时,定义为发病。每个处理设置3个重复,每个重复包含10个芋头。1.4菌落形态观察将菌株在2YT平板上划线培养,30℃条件下培养1~3d,连续观察菌株在2YT平板上的菌落形态。挑取菌体,按照改良的Schaeffer和Fulton氏染色法观察菌体形态和芽孢的形成。1.4.2pcr产物的测序基于生防菌BGP14菌株的16SrRNA和gyrB基因部分序列,对其进行分子鉴定。利用基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取BGP14的基因组DNA。利用16SrRNA通用引物fd2(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和rp1(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增其部分序列,将PCR产物测序。利用gyrB的通用引物UP-1(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和UP-2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)扩增其部分序列,利用测序引物UP-1S(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)和UP-2Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)对PCR产物进行测序。基于获得的16SrRNA、gyrB及GenBank下载的参考序列,利用ClustalX1.83软件分别进行多序列分析。然后,利用MEGA5.05软件分别构建基于16SrRAN和gyrB基因的遗传进化树,选择PseudomonasfluorescensSBW25(NC_012660.1)作为遗传进化树的外围参照菌株。1.5菌落计数测定按照1.3节的描述接种BGP14和Ecc,将接种好的芋头按照1.3节的条件进行孵育。分别于接种后0、1、3、6、10d,调查BGP14和Ecc在芋头伤口上的群体动态。在每个调查时间点,每个处理随机取4个芋头,利用灭菌手术刀将芋头伤口及腐烂部分切下来,放置到灭菌坩埚内,添加2~3mL灭菌水研磨匀浆,最后利用灭菌水定容至15mL。将研磨好的样品梯度稀释,分别涂布2YT平板(调查BGP14菌落数)和含有100μg/mL利福平的2YT平板上。30℃条件下孵育16h,测定Ecc菌落数量。每个处理设置3个重复,每个重复接种25个芋头。1.6酶活力测定按照1.3节的描述接种BGP14和Ecc,将接种好的芋头按照1.3节的条件进行孵育。分别于接种后0、1、3、6、10d取样。在每个调查时间点,每个处理随机取5个芋头。切取与接种伤口及腐烂病斑邻近的组织,切成约5mm×5mm的小块,用液氮速冻,保存在-70℃备用。实验开始时,每个处理取冷藏的样品5g,加入到10mL200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.4)中,再添加0.5g聚乙烯吡咯烷酮。利用匀浆机匀浆,然后在4℃、10000r/min离心40min,上清被用来测定酶活力。参照文献ZhaoYancun等的描述方法测定芋头的苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalaninammonia-lyase,PAL)活性。参照汤章城的描述方法测定过氧化物酶(peroxidase,POD)活性,根据芋头的特点进行了一些改动。反应混合液包括0.5mL的粗提酶液和2mL愈创木酚(100mmol/L磷酸钠,pH6.4,10~50mmol/L愈创木酚,现配现用),在30℃条件下孵育5min。然后加入1mL双氧水(H2O2,24mmol/L),测定470nm波长处的吸光度变化。POD酶活力单位定义:每微克蛋白中每分钟吸光值上升0.01个单位定义为1个酶活力单位(1U)。所有实验数据是3个重复实验结果的平均值。利用Excel2003和SPSS13.0软件对实验结果进行统计分析,采用Tukey’s测验进行差异显著性分析(P<0.05)。2结果与分析2.1土壤细菌生长数据分别从蔬菜田土壤和芋头表面黏附土壤分离纯化了267和244株菌,对其进行平板拮抗实验,结果发现3株(BGP14、BGP67、BGP109)来源于蔬菜田土壤和3株(YT38、YT103、YT231)来源于芋头表面土壤的细菌在含有病原菌Ecc的2YT平板上产生了清晰且明显的拮抗圈(直径>10mm)(图1)。其中,BGP14对Ecc的拮抗圈直径最大,为12.2mm,但是该菌株与其他5个菌株之间差异不显著(P>0.05)。2.2不同处理对植物清液发酵的影响为了进一步评估上述6个拮抗菌株的实际生防效果,分别测定了它们的发酵菌液和无菌上清对贮藏期芋头软腐病发病率的影响。如图2所示,发酵菌液处理芋头的发病率在6.7%~40.0%,均显著低于对照(90.0%)(P<0.05),其中BGP14处理的发病率显著低于YT38、YT103、BGP67和BGP109处理,仅为6.7%;无菌上清液处理芋头的发病率在36.7%~60.0%之间,对贮藏期芋头软腐病也具有一定防治效果,但是明显高于相应发酵菌液处理芋头的发病率。以上实验结果表明,拮抗菌BGP14的发酵菌液对贮藏期芋头软腐病具有良好生防效果。2.3srrna和gyrb的序列及测序结果同源性分析拮抗菌BGP14在2YT培养基平板上的菌落形态为乳白色,表面皱缩、菌体为杆状、形成芽孢。根据以上特征,初步判定为芽孢杆菌。为了进一步确定BGP14的分类地位,利用16SrRNA和gyrB基因序列对其进行了分子鉴定。利用通用引物,我们成功获得了16SrRNA(1432bp)和gyrB(1179bp)的部分序列,并提交到GenBank数据库,序列登陆号分别为JQ734536(16SrRNA)和JQ734539(gyrB)。利用邻接法(Neighbour-Joining)分别构建了基于16SrRNA和gyrB序列的进化树如图3所示。在这两个进化树中,拮抗菌株BGP14都与BacillusamyloliquefaciensFZB42聚类在一起。对这两个菌株的16SrRNA和gyrB基因序列分别进行BLASTn分析,结果发现它们的核酸序列同源性分别为99.9%和99.1%。以上结果表明,BGP14菌株属于Bacillusamyloliquefaciens。2.4生防菌bgp14对4eb群的影响由图4可知,在接种后24h,在仅接种病原Ecc的对照处理和联合接种生防菌BGP14及Ecc的生防处理芋头伤口上,Ecc的群体数量分别下降99.1%和99.3%。随后,对照处理芋头伤口上Ecc的群体数量迅速上升,接种后第10天的菌体密度达到2.0×1011CFU/伤口;但是,在生防处理的芋头伤口上,病原菌Ecc增殖缓慢,接种后第10天的菌体密度为2.3×108CFU/伤口,仅为对照处理的0.1%。上述结果表明,生防菌BGP14显著抑制了Ecc的增殖,从而达到对芋头软腐病的防控。另外,在生防菌与病原菌互作的初期阶段,BGP14的群体密度维持在一个相对恒定的水平,此后缓慢增加。在接种后第10天,BGP14的群体密度达到1.8×109CFU/伤口,是初始接种量的35.6倍。2.5bgp14对芋pal和pod活性的影响PAL和POD是与诱导抗病性紧密相关的酶。图5A表明,在创伤接种处理后,各处理组和对照组芋头的PAL活性均下降,第3天下降到最低点,随后上升。在整个实验过程中,利用生防菌BGP14和病原菌E.carotovora处理芋头的PAL活性始终高于仅接种E.carotovora的芋头,大部分时间内也高于清水对照处理。以上结果表明,在生物防治过程中,BGP14诱导芋头的PAL活性显著上升。图5B表明,病原菌E.carotovora能够诱导芋头POD活性大幅上升,接种后第6天达到最高点,是初始水平的1.93倍,然后迅速下降;在先后利用生防菌BGP14和病原菌E.carotovora处理的芋头上,POD活性迅速上升,在接种后第3天达到最高值,是初始水平的1.73倍,然后迅速下降。灭菌水对照处理芋头的POD活性变化幅度较小。3发酵微生物对馒头软腐病的生防效果胡萝卜软腐欧文氏菌(Ecc)能够引起多种天南星科植物软腐病,例如魔芋、芋头等,大量相关研究主要集中在田间病害的生物防治。截止目前,通过文献检索还没有发现针对贮藏期芋头软腐病生物防治的研究报道。病害的生物防治是一个生防菌、病原菌与寄主互作的复杂过程,并且该过程受到环境因素的影响。通过实验室内的平板拮抗实验,本研究从蔬菜田土壤和芋头表面黏附土壤中共获得6株对病原菌Ecc具有较强拮抗活性的生防菌,但是,这并不表示它们对实际病害具有良好生防效果。deCosta等通过平板拮抗实验从香蕉种植园分离获得32株对香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)具有显著拮抗活性的细菌,但是仅有4株拮抗菌在生产上对香蕉炭疽病表现出良好生防效果。通过活体评价方式,本实验发现仅BGP14菌株的发酵菌液对芋头软腐病具有较好生防效果,处理芋头的发病率仅为6.7%,其他5个菌株处理的发病率为30%~40%。大量研究表明,生防菌主要通过拮抗次生代谢产物的产生、对寄主伤口营养和空间的竞争或诱导寄主抗病性等方式抑制或杀死病原菌,从而阻止或延缓病害的发生及发展。本实验发现,BGP14发酵液无菌上清对芋头软腐病的防效为63.3%,但是其发酵菌液的生防效果高达93.3%,这表明BGP14菌体细胞和其产生的抗菌次生代谢产物在防治芋头软腐病过程中都发挥了重要作用。通过对生防菌BGP14和病原菌Ecc在芋头伤口上的群体竞争动态分析,也发现BGP14在芋头伤口上具有较强的适应能力和增殖能力,并且将Ecc的群体数量压制在一个