医药3 侯健 针对未折叠蛋白反应白想治疗多发性骨髓瘤课件

针对未折叠蛋白反应靶向治疗多发性骨髓瘤侯健全军骨髓瘤与淋巴瘤中心第二军医大学长征医院血液科

针对未折叠蛋白反应靶向治疗多发性骨髓瘤侯健内质网应激与未折叠蛋白反应内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器。有很多物理、化学可导致内质网功能的内稳态失衡,形成内质网应激(ER)内质网应激表现为腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及

Ca2+平衡紊乱。而当错误折叠的蛋白质累积时,细胞通过多条信号转导途径,启动一系列基因的表达，对其进行适应性应答,这些反应称为未折叠蛋白质反应(UPR)内质网应激与未折叠蛋白反应内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠内质网应激，未折叠蛋白反应及细胞命运CHOP通路：是一个TF，在ER应激的ATF6和PERK通路中被诱导表达IRE1/TRAF2/ASK1/caspase12通路Ca2+通路FromAllenVolchuk’slabwebsiteMetazoanUPRnonconventionalsplicing未折叠蛋白反应包括增强蛋白质折叠能力、停滞大多数蛋白质的翻译、加速蛋白质的降解等.如果内质网功能紊乱持续,细胞将最终启动凋亡程序.内质网应激，未折叠蛋白反应及细胞命运CHOP通路：是一个TF未折叠蛋白反应通过四种机制缓解内质网应激减少蛋白合成，防止未折叠蛋白的积聚。(停产整顿)诱导内质网伴侣分子，增强蛋白质折叠能力。（弥补过失）诱导内质网相关的蛋白降解，加速错误折叠蛋白降解。（清除影响）诱导凋亡，清除内质网应激中受损细胞（找替罪羊）4未折叠蛋白反应通过四种机制缓解内质网应激减少蛋白合成，防止未细胞处理未折叠蛋白的途径E1:泛素激活酶E2:泛素结合酶E3:泛素连接酶细胞处理未折叠蛋白的途径E1:泛素激活酶ToruHosoiandKoichiroOzawa/ClinicalScience(2010)118,19–296未折叠蛋白反应传感器及信号转导ToruHosoiandKoichiroOzawa骨髓瘤细胞的软肋

骨髓瘤患者血清M蛋白可以超过100g/L(甲胎蛋白是以μg/L为单位的)骨髓瘤细胞含有丰富的内质网，每分钟可以分泌10000至80000个M蛋白分子其中1/4至1/3可能发生错误折叠未折叠或错误折叠的蛋白可以导致骨髓瘤细胞凋亡骨髓瘤细胞未折叠蛋白反应处于激活状态骨髓瘤细胞的软肋

骨髓瘤患者血清M蛋白可以超过100g/L未折叠蛋白反应：治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点真核起始因子2(eIF2)α磷酸酶抑制剂CancerRes.2009;69(4):1545-52.肌醇需求激酶1(IRE1)抑制剂Blood.2011;117(4):1311-4.

热休克蛋白(HSP)抑制剂SAHA组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂:vorinstatandPanobinostat(PhaseIIItrial)第二代蛋白酶体抑制剂:carfizomibandNPI-0052PERK抑制剂和GRP-78抑制剂一石二鸟：联合治疗未折叠蛋白反应：治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点真核起始因子2(我们的初步探索2-甲氧基雌二醇三氧化二砷衣霉素和二硫苏糖醇过氧化物酶体增殖激活受体（PPRAγ）配体我们的初步探索2-甲氧基雌二醇2-甲氧基雌二醇（2ME2）雌二醇生理代谢产物，在孕妇尿液中大量存在诱导包括骨髓瘤在内的多种肿瘤细胞凋亡2-甲氧基雌二醇（2ME2）雌二醇生理代谢产物，在孕妇尿液中低剂量2ME2作用72H后CZ-1细胞的形态学改变（×1000）abc对照组0.5μm0.1μmabc对照组0.5μm0.1μm0.5μmol/L2ME2作用72h后，LP-1，NCI-H929及CD138(+)骨髓瘤细胞的形态转变

acbfedLP-1NCI-H929原代骨髓瘤细胞对照组0.5μmol/LacbfedLP-1NCI-H929原代骨髓瘤细胞对照组0.0.5μmol/L2ME2对骨髓瘤细胞形态的影响对照组36h72h0.5μmol/L2ME2对骨髓瘤细胞形态的影响对照组36不同浓度2ME2对CD49e表达的影响不同浓度2ME2对CD49e表达的影响2-ME2作用时间对骨髓瘤细胞分泌轻链蛋白量的影响

2-ME2作用时间对骨髓瘤细胞分泌轻链蛋白量的影响0.5μmol/L2ME2对XBP-1m-RNA表达的影响CZ-1LP-1NCI-H9290h36h72h72h36h72h36h0h0hCZ-1LP-1NCI-H9290h36h72h72h36h0.5μm2ME2对XBP-1蛋白表达的影响CZ-1LP-1NCI-H9290h36h72h72h36h72h36h0h0h0.5μm2ME2对XBP-1蛋白表达的影响CZ-1L2-甲氧基雌二醇（2ME2）低剂量2ME2可以诱导骨髓瘤细胞分化形态免疫表型分泌功能其机制与B细胞生理性分化以及UPR的共同信号途径XBP-1有关2-甲氧基雌二醇（2ME2）低剂量2ME2可以诱导骨髓瘤细胞XBP-1转录因子浆细胞成熟未折叠蛋白反应B细胞UPR诱导剂调整UPR相关的基因

死亡＆生存骨髓瘤细胞分化??XBP-1:未折叠蛋白反应浆细胞分化的交汇点XBP-1转录因子浆细胞成熟未折叠蛋白反应B细胞UPR诱衣霉素和二硫苏糖醇

UPR诱导剂促进骨髓瘤细胞的分化衣霉素和二硫苏糖醇

UPR诱导剂促进骨髓瘤细胞的分化UPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化

形态学改变(400×)Control

PrimarycellU266RPMI-8226

TM0.4μM72hDTT0.5mM72hUPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化

形态学改变(400×)ConUPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e的表达

U266细胞对照

U266细胞处理48hU266细胞处理72hRPMI-8226

对照RPMI-822648hRPMI-822672hUPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e的表达

U266细UPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e表达衣霉素对骨髓瘤细胞CD49e表达上调二硫苏糖醇对骨髓瘤细胞CD49e表达上调UPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e表达衣霉素对骨髓瘤衣霉素处理二硫苏糖醇处理UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度衣霉素处理二硫苏糖醇处理UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度原代细胞轻链蛋白浓度(ng/ml)controlTMDTTP1221.67±12.80997272.26±24.68054300.2467±20.30067P2150.3267±10.07765183.0133±11.93228216.25±21.43236P3309.0067±14.97354304.44±17.1242353.92±17.55123P4116.5433±14.92698168.0067±3.634871181.57±13.88213P5228.17±11.62626266.1367±11.31137252.9767±13.16729P6132.7733±12.28007170.74±12.30985145.07±6.704063P7104.7067±9.94438150.15±5.780035157.82±7.013905P895.02±5.056606130.8767±4.995053120.11±10.84287UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度原代细胞轻链蛋白浓度(ng/ml)controlTMDTTPUPR诱导剂上调GRP78,GRP94的表达

GRP78GRP94

UPR诱导剂上调GRP78,GRP94的表达GRP78GUPR诱导剂上调XBP-1u,下调XBP-1sXBP-1uXBP-1s

RealtimeRT-PCRUPR诱导剂上调XBP-1u,下调XBP-1sXBP-1uX衣霉素处理后蛋白质印迹结果β-actinXBP-1sXBP-1u

对照24h48h72h对照24h48h72h

U266

RPMI-8266衣霉素处理后蛋白质印迹结果β-actinXBP-1sXBP-二硫苏糖醇处理后蛋白质印迹结果β-actinXBP-1sXBP-1u

对照24h48h72h对照24h48h72h

U266

RPMI-8266二硫苏糖醇处理后蛋白质印迹结果β-actinXBP-1sXB小结小剂量的未折叠蛋白诱导剂对多发性骨髓瘤具有促分化作用细胞形态上更接近成熟浆细胞分泌的轻链蛋白的量增加表面标记CD49e表达增加GRP78,GRP94↑发生了未折叠蛋白反应在转录和翻译水平XBP-1u↑,XBP-1s↓证实，除了急性早幼粒细胞白血病（APL）以外，多发性骨髓瘤也可以采用诱导分化的治疗策略小结小剂量的未折叠蛋白诱导剂对多发性骨髓瘤具有促分化作2-甲氧基雌二醇通过干扰诱导性聚集体的形成而增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的凋亡效应。聚集体是一种特殊细胞器，可以将未折叠蛋白运输到溶酶体通过自噬途径降解。聚集体形成与微管聚集和解聚有关，受到乙酰化和去乙酰化调控、修饰。2-甲氧基雌二醇2-甲氧基雌二醇通过干扰诱导性聚集体的形成而增强硼替佐米对骨[医药]3侯健针对未折叠蛋白反应白想治疗多发性骨髓瘤课件E电镜观察RPMI-8226及NCI-H929细胞中的聚集体，可见聚集体位于细胞质和胞核中F免疫荧光可见NCI-H929细胞中的aggresome位于胞核和胞质中破坏硼替佐米诱导生成的聚集体从而促进骨髓瘤细胞凋亡。基线硼替佐米硼替佐米+2-甲氧基雌二醇6.6(U266)75.313.88.9(8226)69.119.5聚集体阳性细胞(%)E电镜观察RPMI-8226及NCI-H929细胞中的聚集PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2曲格列酮PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2多发性骨髓瘤治疗的新靶点

应用配体激活PPARγ进而阻断STAT3信号靶向治疗WangLH,etal.Immunity,2004;29(2):113–116.多发性骨髓瘤治疗的新靶点应用配体激活PPARγ进而阻探索新靶点在国际上首次报道应用配体激活PPARγ阻断STAT3信号转导通路，诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。探索新靶点在国际上首次报道应用配体激活PPARγ阻断STATWeberSM,etal.AmJPhysiolEndocrinolMetab.2004;287(6):E1171-7PPARγ配体诱导内质网应激胰岛β细胞以减弱细胞因子信号

WeberSM,etal.AmJPhysiol三氧化二砷三氧化二砷抑制组蛋白去乙酰化酶活性，促使α微管蛋白及HSP90乙酰化,

以此干扰聚集体的形成及IκB激酶α的折叠三氧化二砷HDAC调节的蛋白组蛋白去乙酰化酶调节的蛋白HistoneHDACsHDACs-tubulinHSP90HIF-1aHDACsHDACsHDACs抑癌基因活性抑癌功能丢失微管解聚/聚集体形成

血管内皮生长因子癌基因下游效应细胞周期停滞凋亡细胞运动，侵袭细胞增殖和存活血管发生肿瘤细胞的反应p53组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）治疗多发性骨髓瘤主要是通过调节两个蛋白来发挥作用,分别是热休克蛋白90和α-微管蛋白。

HDAC6HDAC组蛋白去乙酰化酶调节的蛋白HistoneHDACsH结果0.1μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性为对照组的83.5%，与对照组无明显差异（P＞0.05）0.5，1，2，4μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的76.8%，72.3%，69.1%和62.8%（P＜0.05）2μmol/L的As2O3分别处理细胞0h,24h,48h，24h组和48h组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的74.7%和66.3%（P＜0.05）结果0.1μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性为对As2O3对

-微管蛋白乙酰化的影响NCI-H929细胞随着处理浓度增加和处理时间的延长，

-微管蛋白的乙酰化水平增加As2O3对-微管蛋白乙酰化的影响NCI-H929细胞随着上海长征医院As2O3对HSP90乙酰化水平的影响2.5μmol/L和5μmol/LAs2O3处理MM细胞株

NCI-H92948h后，与对照组相比，HSP90的乙