石蜡切片免疫组化步骤

石蜡切片免疫组化步骤脱蜡复水二甲苯1（10min）—二甲苯II（10min）―二甲苯III（10min）—无水乙醇I（10min）―►无水乙醇II（5min）—95%乙醇（5min）f70%乙醇（3min）f50%乙醇（3min）f30%乙醇（3min）—1XPBS浸泡（5min）。抗原修复将抗原修复液（250ml）加入开口容器中，放入微波炉中高火（9档）6min左右沸腾，然后将玻片放入后，使用低火（3档）4min，微波炉中冷却5min,重复三次。（注意液面是否下降，如是需补充等温的缓冲液，或可放置一杯蒸馏水在微波炉中同时加热。）从微波炉中取出，室温等待缓冲液彻底冷却后（大约30-45min），取出玻片。TIP：修复液（柠檬酸：0.1g，柠檬酸钠：0.75g，溶于250mL去离子水）。用PBS洗（浸泡或冲洗）三次，每次5min。（期间用组画笔（疏水性油性蜡笔）圈出阻止范围，以节省抗体）。FP：抗原决定簇在4%PFA固定过程中遭到破坏，因此需要复性过程以使抗原决定簇重新暴露出来，利于抗体结合。封闭封闭液为5%的二抗同源血清，配方为：[940plIxPBS+50plserum+10pl10%BSA]室温封闭1h，在湿盒中进行。结束后将载玻片竖立于吸水纸上，去除封闭液。不需要洗！Tip:从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景Tip：如不使用二抗同源血清，也可使用3%~5%BSA进行封闭。Tip:封闭作用：空间占位。BSA能非特异性的与表面抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会与非特异性的抗原结合，以降低背景。Tip：Thesecondaryantibodymaycrossreactwithendogenousimmunoglobulinsinthetissue.Minimizethisbypre-treatingthetissuewithnormalserumfromthespeciesinwhichthesecondarywasraised.Tip：TheuseofnormalserumbeforetheapplicationoftheprimaryalsoeliminatesFcreceptorbindingofboththeprimaryandsecondaryantibody.BSAisincludedtoreducenon-specificbindingcausedbyhydrophobicinteractions.孵育一抗一抗稀释液：dilutionin0.1%serum,0.1%BSAin1xPBS[989pl1xPBS+1plserum+10pl10%BSA]。将稀释好的抗体滴加到蜡圈内的组织上，4°C过夜，在湿盒中进行。对照用同型IgG代替一抗。第二天取出后，室温恢复30-45min，结束后将载玻片竖立于吸水纸上，轻轻抖掉一抗，随后再甩几下，使用PBS在摇床上洗三次，每次10min。Tip：Dilutetheprimaryantibodytothemanufocturer’srecommendationsortoapreviouslyoptimizeddilution.MostantibodieswillbeusedinIHC-Pataconcentrationof0.5-10gg/mL.去除内源性过氧化氢酶玻片取出，放入3%的H2O2（PBS45ml+30%H2O25ml）,室温孵育避光处理15min,消除内源性过氧化氢酶活性。PBS浸泡清洗三次，每次5min。Tip：这里将去除内源性过氧化氢酶步骤放到孵育完一抗之后。使用PBS稀释。原因：Someepitopesaremodifiedbyperoxide,leadingtoreducedantibody-antigenbinding.Incubatesectionswithperoxideaftertheprimaryincubationtoavoidthisproblem.PeroxidecanbedilutedinTBSorwater.Methanolisusefulforbloodsmearsorotherperoxidase-richtissues;peroxidedilutedinmethanoltendstoreducetissuedamagecausedbythereactioninaqueoussolutions.Forothertissue,diluteinTBSorwater.Reducedbindingofsomeantibody-antigenpairs,inparticularcellsurfaceproteins,hasbeenobservedaftermethanol/peroxideincubation.IfusingAPorfluorescentdetection,omitperoxidasequenchingasitonlyappliestoHRPconjugates.孵育二抗dilutionin0.1%serum,0.1%BSAinIxPBS[989glIxPBS+1plserum+10pl10%BSA]避光操作。滴加一定稀释倍数HRP标记的二抗。室温孵育1-3h。使用PBS在摇床上洗三次，每次10min。TIP：二步法信号增强剂。孵育增强液，30min,洗三次，3min/次，滴加孵育二抗，30min,洗三次，5min/次。DAB显色：DAB显色需要在避光条件下进行，具体的显色时间根据抗体以及抗体浓度的不同需要调整，建议每隔30s镜检一次。DAB显色结果阳性应为特异性的棕黄色。显色完成，及时放入PBS中终止反应，防止显色过深。复染：复染的目的是为了使组织形态更加容易分辨且更美观，常用的复染试剂为苏木精，苏木精着色部位为细胞核。在显色完成后的片子上滴加苏木精染色1min-10min，将片子放入水中，上下刷几次。然后缓流自来水冲洗。（水洗的作用是洗去未与切片结合的染液）。光镜下观察着色，依据效果可以进行复染。随后自来水冲洗10-15min。Tip:不同实验室所使用的苏木精着色能力不同，需要进行摸索。本实验室苏木精染色时间为9min。分色每张片子在酸乙醇（1%盐酸乙醇溶液）中上下涮2次，并立即转入dH2O中上下涮2次。将片子放于流动的自来水中冲洗2min以上。蓝化将片子放于1%的氨水中2min，随后转入dH2O中上下涮两次，将片子放于流动的自来水中冲洗2min。脱水透明30%乙醇3min，50%乙醇3min，70%酒精3min，85%酒精3min，95%