医学分子生物学新技术应用

医学分子生物学新技术应用代谢组学及研究技术microRNA的研究及应用免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）4.胞内RNA分子可视技术第一节代谢组学及其研究进展什么是代谢组学？代谢组学研究方法代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）核磁共振技术（NMR）代谢组学研究什么？？生物体系（细胞、组织或生物体）代谢产物发生变化（种类，随时间变化）特定基因突变环境变化生物体系代谢组学研究对象体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体

糖类

脂类蛋白质水

无机盐维生素各种物质代谢之间互有联系，相互依存。

消化吸收中间代谢废物排泄机体物质代谢不断受到精细调节机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度内外环境的变化对机体代谢造成影响适应环境的变化精细的调节控制

代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomics／metabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。

代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究,这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。普遍定义代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。特点1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。代谢组学的发展198219831984198919992000200120022007VanDeGreef:

publicationofMSforurineprofilingSadler,BuckinghamandNicholson:

Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:

PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAnttiExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublications研究方法研究步骤：生物组织，体液经灭活预处理多个方法联用ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics应用药物研发疾病研究植物代谢组学微生物代谢组学中药现代化连接图数据库ConnectionsMapDB京都基因与基因组百科全书KEGG()生物化学途径ExPASy互联网主要代谢途径mainmetabolicpathwaysonInternert,MMPDuke博士植物化学和民族植物学数据库Arizona大学天然数据库Wiley_handbookofgc-ms新药及其代谢产物质谱库“肿瘤”代谢组数据库Pubmed化合物数据库NIST质谱数据库一些有用的数据库：代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)液相色谱-质谱联用技术（LC-MS)毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS)核磁共振技术（NMR）分析技术1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）工作原理：气相色谱仪接口质谱仪常压高真空离子源质量分析器检测器质谱仪的基本结构及工作流程

几种新的GC-MS技术全二维气相色谱质谱技术（GC×GC-TOFMS）气化室检测器色谱柱1色谱柱2调制器研究实例用LecoChromaTOFsoftware得到的质荷比为73（m/z）的离子碎片典型GC×GC-TOFMS二维血浆色谱图（AnalyticaChimicaActa，2009，633，257-262）大连化物所许国旺教授分析确定5种糖尿病病源标记物：葡萄糖、2-羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。脂肪酸代谢紊乱GC-MS适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。2.液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）

LC工作原理：液相色谱-质谱联用的新技术4000QTrapLC/MS/MS高效液相色谱系统配合液相质谱系统。健康和慢性乙肝病人的血清样本。使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（JournalofProteomeResearch,2006,5,554-561）

新型液相色谱技术UPLC新型超高液相色谱仪HPLC色谱柱填料颗粒：3、5μmUPLC色谱柱填料颗粒：1.7μm分离能力得到空前提高

比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描（RapidCommunMassSpectrom,2005,19,843）UPLC在代谢组学中的研究优势UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。）毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学）

型号：P/ACEMDQ-DecaXPplus

厂家：美国BeckanCoulter-Finnigan

（NMR）基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。1H-NMR：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。核磁共振电子云：基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的H和C原子的位置信息。

hr-MASofbiologicaltissue相同强度LipidCH2-COLipidCH2-C=CLipidCH2-CH2-COLipidCH2LipidCH3CitrateLactateAlanine放大＊１０人前列腺组织（prostatetissu）良性vs.恶性癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid）！！！代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(PrincipleComponentsAnalysis,PCA)。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。microRNA的研究与应用3510.1.1概述10.1.2.microRNA的分子生物学研究方法10.1.3microRNA的实验技术10.1.4microRNA与疾病内容结构36概述miRNA是由21~25个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。?什么是miRNA？37概述·

MicroRNA的发现lin-4:Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。

lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。

L1

L2

L3

L4L1~L4，线虫发育的四个不同阶段38let-7:Rinhart等人于2000年在线虫发现第二个miRNA，let-7。

let-7在L3,L4阶段大量表达，控制幼虫的L4阶段向成虫阶段发育转换。L1~L4，线虫发育的四个不同阶段

L1

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L4概述·

MicroRNA的发现39MicroRNA的起源与生物合成过程1.miRNA基因被转录成pri-miRNA(RNA聚合酶Ⅱ)；2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷酸的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)；3.pre-miRNA从核内被转移至胞质(Exportin-5,Ran-GTP)；4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链RNA双体(Dicer,TRBP,PACT)；5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。40MicroRNA的起源与生物合成过程microRNAgenePolⅡ

①②

Drosha/DGCR8Pri-miRNAPre-miRNACytoplasm③④Dicer/TRBP/PACTduplexintermediate⑤

RISCmaturemiRNAmiRNAbiogenesis

NucleusExportin-5/Ran-GTP41miRNA与siRNA的性质比较miRNAsiRNA相同点长度及特征分子量约22nt，5'端是磷酸基，3'端是羟基合成的底物均由双链RNA或RNA前体加工而来Dicer酶依赖Dicer酶并具有Dicer加工产物的特征Argonaute家族蛋白均需Argonaute家族蛋白参与RISC均为RISC组分，在介导沉默机制上有相似之处作用方式均可抑制靶基因翻译或导致mRNA降解进化关系两种假设：siRNA是miRNA的补充；miRNA在进化过程中替代了siRNA

引自方福德,microRNA的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社,200842miRNAsiRNA不同点机制性质是生物体正常的调控机制往往是外源引起直接来源发夹状pre-miRNA长链dsRNA分子结构单链RNA双链RNA，3‘端有2个非配对碱基对靶基因mRNA特异性较低，一个突变不影响miRNA的抑制作用较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变作用方式miRNA途径RNAi互补性不完全互补，存在错配现象一般要求完全互补生物学功能对机体的生长发育有重要作用抗病毒的防御机制；沉默过表达的mRNA；保护基因组免受转座子侵入重要特性高度的保守性、时序性和组织特异性高度特异性续表143miRNAsiRNA不同点作用机制通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶基因mRNA，并与之部分互补，从而抑制其翻译。在动物中，成熟的miRNA与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合mRNA3‘-UTR，从而抑制其翻译。miRNA也可切割完全互补的mRNA渗入RISC中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNA，通过反义siRNA链识别目的mRNA，通过内切酶活性切割目的片段，再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。siRNA也可以抑制具有短片段互补性的mRNA翻译加工过程不对称加工，仅剪切pre-miRNA一个侧臂，其他部分降解对称地剪切来源于双链RNA前体的两个侧臂对RNA的影响与mRNA的稳定性无关影响mRNA的稳定性作用位置作用于靶基因3‘-UTR作用于mRNA的任何部位生物学意义主要在发育过程中发挥作用，调节内源性基因的表达不参与生物发育，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性与抵御病毒感染续表244MicroRNA的鉴定

正向遗传学的突变筛查方法（最初几个miRNA分子的发现；效率不高）；cDNA克隆技术（有优势也有不足）；生物信息学预测方法（是实验预测方法有益和必要的补充；目前两个最主要的miRNA基因预测工具：MiRscan和miRseeker）

当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定

45MicroRNA的特征广泛存在于真核生物中,是一类内源性表达的非编码短序列RNA,本身不具有开放阅读框(ORF)；成熟的miRNA长度通常为21～25nt；miRNA在进化上具有高度保守性；miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性

如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达

46MicroRNA的功能miRNA通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。47miRNA靶基因功能作用lin-4lin-14,lin-28线虫早期时序发育let-7lin-41,RAS线虫晚期时序发育lsy-6Cog-1线虫神经系统发育mir-273Die-1线虫神经系统发育bantamHid果蝇细胞凋亡mir-14未知果蝇细胞凋亡及脂类代谢mir-430未知斑马鱼神经发育mir-181未知小鼠B淋巴细胞分化mir-375Mtpn小鼠胰岛素分泌mir-15/16BCL-2人B淋巴细胞慢性白血病mir-155未知人弥散性大B淋巴瘤mir-17-92E2F1人B细胞淋巴瘤和肺癌部分已知功能的miRNA引自方福德,microRNA的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社,200848miRNA靶基因功能作用mir-223NF1A人粒系分化mir-23bHes1小鼠神经发育mir-206Connexin43鸡骨骼肌发育mir-125a/bERBB2,ERBB3调节原癌基因的表达mir-1未知影响人脂肪基质细胞成肌潜能mir-133a未知人肌细胞发育mir-9aSens调节果蝇感官发育mir-122未知人肝癌发生续表49MicroRNA的调控机制mRNA剪切

miRNA与靶mRNA几乎完全互补；切割位点在从5‘端起与miRNA配对的第10位和11位核苷酸之间；由RISC中的内切酶催化完成；可催化多个mRNA分子的降解翻译抑制

miRNA与靶mRNA互补程度较低；翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段；翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达50MicroRNA表达的研究方法

miRNA基因芯片技术，高通量检测miRNA表达情况的最佳选择；PAGE/Northernblotting杂交法，可用于miRNA表达水平的定量检测，还能与RNAmarker结合使用检测miRNA分子的大小，用来排除其他小分子RNA的污染；原位杂交，可直观显示生物体miRNA的时间和组织特异性表达谱；miRNA实时定量PCR，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。51miRNA功能研究的主要实验策略引自JKrtzfeldt,MatthewNPoyandStoffel.StrategiestodeterminethebiologicalfunctionofmiRNAS.NatureGenetics,2006,38(suppl):S14-S19DicermutantsGlobalmiRNAKnockoutTissue/cellsmiRNAidentificationPhenotypeGeneexpressionprofilingmiRNAoverexpressionmiRNASilencingMicroarraygeneexpressionTargetvalidationRescuePhenotypePhenotypePhenotypeDiseasemodelmiRNAprofilingGeneexpressionprofilingNormalizemiRNAprooverexpression/silencingBioinformatics52MicroRNA功能研究方法

miRNA体外或体内水平的过表达研究

构建相应的表达载体体外合成miRNA前体分子miRNA表达抑制研究

基因水平抑制miRNA表达使用反义核酸分子抑制miRNA表达53miRNA基因克隆（一）基本原理：miRNA克隆是依赖于其本身的特殊结构，5′端的磷酸基团和3′端的羟基基团，以T4RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到合适的载体，最后测序验证。（二）应用：microRNA基因克隆主要用于寻找新microRNA基因，同时还可获得精确的表达信息。55MichaelMZ,2006TotalRNA5'POH3'PAGEsizeseparation5'HOOH3'Phosphatase5'HOT4RNAligase5'PP3'3'adapterP3'5'PP3'T4polynucleotidekinase-OH3'P3'T4RNAligaseP3'BanⅠBanⅠ5'adapterRT-PCRBanⅠBanⅠdigest,religate,ligateintoplasmidvectorandsequenceinsertsmiRNA基因克隆策略56miRNA基因克隆的基本步骤（一）总RNA的提取关键：尽量不使小RNA丢失（二）小分子RNA分离纯化及富集变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）方法是用于小分子RNA分离纯化的理想方法。（三）小分子RNA片段修饰小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端连接上连接子等57miRNA基因克隆的基本步骤（四）克隆及测序鉴定含3‘与5’端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。（五）PAGE/Northernblotting验证

PAGE/Northernblotting方法是确认microRNA最有效和常用的方法。58PAGE/Northernblotting（一）基本原理：PAGE/Northernblotting与常规核酸杂交技术原理相同，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差别在于选择对小分子RNA分离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为分离胶。（二）应用：PAGE/Northernblotting方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的RNA分子，在验证micorRNA基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技术。59PAGE/Northernblotting基本操作步骤（一）总RNA的提取关键：尽量不使小RNA丢失（二）样品处理取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中混匀，55℃孵育30min，冰浴后准备PAGE分离。（三）PAGE分离、转膜及固定60PAGE/Northernblotting基本操作步骤（四）寡核苷酸探针的制备探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子（五）杂交、洗膜、压片及显影（六）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，避免放射性污染。61MicroRNA基因芯片技术

基本原理：MicroRNA基因芯片的基本原理与以往传统基因芯片的使用原理基本相同，即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原则杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进行检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。62MicroRNA基因芯片技术主要应用：

（1）寻找和发现新microRNA基因；（2）miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、白血病、糖尿病等；（3）药物筛选和药物开发等；

63MicroRNA基因芯片技术操作流程示意图LiW,RuanKC.200964MicroRNA基因芯片技术操作流程（一）MicroRNA基因芯片的设计与制作可根据实验需要自行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购买芯片（二）RNA提取与纯化（三）RNA样品的标记

MicroRNA芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的microRNA，并且结果具有可重复性。因此，选择合适的microRNA标记系统是实现芯片表达谱检测精确性的一个保证。65MicroRNA基因芯片技术操作流程（四）芯片杂交及后处理由于microRNA分子量小，因此，杂交反应条件及杂交后洗脱条件需谨慎选择。（五）图像采集和数据分析

MicroRNA基因芯片图像的采集和分析是microRNA芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应用。（六）验证由于microRNA基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用PAGE/Northernblotting、定量PCR等方法验证。66MicroRNA实时定量PCR基本原理：利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR产物的动态累积，得到S型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。67MicroRNA实时定量PCR主要应用：

（1）microRNA的定量检测，可精确检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平；（2）由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生；（3）应用于临床诊断和治疗等。68TaqMan™MicroRNA实时定量PCR示意图5′3′microRNARTprimercDNAForwardprimerReverseprimerQFReal-timePCRReversetranscriptionTaqManprobeChenCF,RidzonDA,BroomerAJ,etal.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem–loopRT–PCR.NucleicAcidsRes.2005;33(20):e17969MicroRNA实时定量PCR操作步骤（一）总RNA提取、小分子RNA的分离纯化及富集（二）逆转录反应

MicroRNA的逆转录反应与普通的针对mRNA的逆转录反应过程基本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等。（三）实时定量PCR

针对microRNA的实时定量PCR的热学反应条件要谨慎选择。70MicroRNA与疾病MicroRNA与人类疾病包括肿瘤、糖尿病、炎症、心脏疾病、病毒感染等的发生密切相关。

MicroRNA造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的microRNA表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的microRNA表达上调等。71microRNA引发癌症的可能原因：（1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的；（2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域；（3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控

72充当抑癌基因作用的miRNA:miR-15a和miR-16-1:这两个miRNAs的缺失或下调，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。mir-143和mir-145:在结肠癌中明显下调充当癌基因作用的miRNA:

miR-21:在胶质母细胞瘤中表达增加

miR-155:在Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中表达上升肿瘤类别表达变化趋势microRNAID经验证的靶基因

肺癌表达上调miR-26a1miR-21TPM1miR-24-1(miR-189)miR-17-92miR-30amiR-143ERK5miR-145miR-188miR-331

表达下调miR-200bLet-7HMGA2,RAS目前肺癌中已经表达分析及初步功能研究的部分microRNA74MicroRNA与糖尿病MicroRNA引发糖尿病的可能原因：（1）MicroRNA参与胰岛素的合成分泌调节；（2）MicroRNA对血糖代谢起着直接或间接的调控作用；（3）MicroRNA与脂质代谢密切相关；75已知功能的部分miRNA与糖尿病的关系AmitK.Pandey,etal.,200976miRNA的综合信息网站：http://77免疫共沉淀技术ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsShenetal,GenesandDevelopment.2010ShenetalMBC2009ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsShenetal2010ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics参考文献1.ZhifaShen,AnikSt-DenisandPascalChartrand.Cotranscriptionalrecruitment