生物化学实验-电泳市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件

生物化学试验

Biochemical

Experiment1/96人员组成主讲教师：吕晓玲（教授）刘常金（副教授博士）曹东旭（副教授博士）王德培（副教授博士）白小佳（讲师博士）李昌模（副教授博士）张燕（副教授博士）方国臻（副教授博士）试验辅助：高辉（试验师）姚秀玲（试验师）2/96试验内容安排共36课时1、生物化学试验规则及惯用仪器使用入门（2课时）2、离子交换柱层析法分离氨基酸（5课时）3、3，5－二硝基水杨酸法测定还原糖（5课时）4、多酚氧化酶制备、性质及其影响原因（6课时）5、碱性蛋白酶活力测定－福林酚试剂法（4课时）6、SDS－PAGE分离蛋白质（6课时）7、植物中核酸分离与判定(5课时)8、Bradford法测定蛋白质含量（3课时）3/961试验目标掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、纯化和测定技术原理及方法；掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验技能；培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作风、创新能力等综合素质。

绪论4/962经过生物化学试验应该做到学习设计一个试验基本思绪，掌握各个试验基本原理，学会严密地组织自己试验，合理地安排试验步骤和时间。训练试验动手能力，学会熟练地使用各种生物化学试验仪器。学会准确翔实地统计试验现象和数据技能，提升试验汇报写作能力，能够整齐清洁地进行全部试验。掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实基础。5/963.1试验统计试验前写好试验预习汇报(钢笔和园珠笔)。试验中应及时准确地统计(专用纸，事先在统计纸上设计好各种统计格式和表格）所观察到现象和测量数据。试验统计要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观察二次以上，即使观察数据相同或偏差很大，也都应如实统计，不得涂改。试验中要详细统计试验条件，如使用仪器型号、编号、生产厂等；生物材料起源、试剂规格、试剂浓度等。

3试验统计与试验汇报6/963试验统计与试验汇报3.2试验汇报试验汇报格式应为：⑴试验目标；⑵试验原理；⑶仪器、材料和试剂；⑷试验步骤；⑸结果讨论（含数理据处）；⑹注意事项;(7)思索题注意：试验结果讨论要充分，尽可能多查阅一些相关文件和教科书，充分利用己学过知识和生物化学原理，进行深入探讨，勇于提出自己独到分析和看法，并欢迎对试验提出改进意见。7/964试验成绩评分方法试验预习情况（10%）试验操作情况（20%）试验汇报情况（30%）试验考试成绩（40%）8/96生物化学试验技术理论层析技术9/9619，俄国科学家M.C.Jber首创了一个从绿叶中分离各种不一样颜色色素成份方法，命名为色谱法(Chromatography)，因为翻译和习惯原因．又常称为层析法。80多年来，层析法不停发展，形式各种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。几乎每一个层析法都已发展成为一门独立生化高技术，在生化领域内得到了广泛应用。一、层析技术10/96一、层析技术1、层析技术原理2、层析技术分类3、惯用层析技术原理11/961、层析技术原理层析原理：是一个物理分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分以不一样程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相当作流动相，并使各组分以不一样速度移动，从而到达分离目标。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。12/962、层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析凝胶过滤固体液体分子大小13/963、惯用层析原理（1）分配层析——纸层析原理：溶质在互不相溶两相中溶解度不一样，在终点时到达一个平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。固定相内溶质浓度流动相内溶质浓度固定相：滤纸上吸附水流动相：有机溶剂（正丁醇）α=14/9612864643264321648481683248328420404020421230403012215/96纸层析纸层析是最简单液一液相分配层析。滤纸是纸层析支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸纤维素牢牢吸附，所以，纸及其饱和水为层析固定相，与固定相不相混溶有机溶剂为层析流动相。对一些特定化合物，在特定展层系统，一定温度条件下，Rf是个常数。16/96（2）离子交换层析原理：将能与周围介质进行离子交换不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中组分。惯用惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交换离子：阳离子：Na+、H+

阴离子：Cl-、OH-17/96示意图（交换树脂表面）18/96示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子19/96示意图水分子B物质A物质20/96（3）吸附层析原理：当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成原因：吸附作用可能由几个作用力形成，包含被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不一样条件下，占主要地位作用力可能不一样，也可能几个力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。21/96吸附层析示意图吸附剂易吸附分子不易吸附分子22/96（4）亲和层析原理：利用分子间含有专一亲和力而设计层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。23/9624/96（5）凝胶过滤原理：被分离物质因分子大小不一样，在凝胶中向下移动速度不一样。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，所以向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。25/9626/96电泳技术一.电泳概念二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理四.几个常见电泳方法比较五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理27/96一.电泳概念带电质点在电场中移动现象。28/96二.电泳技术分类29/96三.电泳技术基本原理1.基本原理

不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状相关。pH>pI分子带负电荷,在电场中向正极移动;

pH<pI分子带正电荷,在电场中向负极移动;

泳动度u=v=d/t=dleV/lVt30/962.影响电泳速度原因(1)电场强度泳动速度与电场强度成正比常压电泳(100—500V).2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质;高压电泳(500—1000V).20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质;（2）溶液pH值pH距待分离物质pI越远，泳动速度越大；（3）溶液离子强度离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。（4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物相对移动。31/96四.几个常见电泳比较类型优点缺点纸电泳设备操作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调整凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离32/96五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理1.原理

含有电泳和分子筛双重作用2.聚丙烯酰胺凝胶聚合单体：丙稀酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)

催化剂聚合形成三维网状结构。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH

-CH2-NH-C-CH=CH233/96五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理2.聚丙烯酰胺凝胶聚合催化剂（1）过硫酸铵-TEMED系统碱性条件下催化作用温度与聚合快慢成正比（2）核黄素-TEMED系统光激发催化反应用量少，对分析样品无影响聚合时间可自由控制34/96五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理3.聚丙烯酰胺凝胶孔径凝胶越浓T，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度

丙稀酰胺浓度分离物质分子量4％大于100万7－7.5％1－100万15－30％小于1万胶孔径为蛋白质分子平均大小二分之一时效果好凝胶强度选择先用7.5%标准凝胶或4%--10%凝胶梯度测试35/96五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理4.缓冲系统选择pH、离子种类和离子强度

酸性蛋白质高pH碱性蛋白质低pH连续和不连续系统

电泳槽中缓冲系统和pH与凝胶相同电泳槽中缓冲系统和pH与凝胶相同，分辨率高36/965.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（1）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳四个不连续性A.凝胶层不连续性

浓缩胶T=2.8％C=20%；分离胶T=7％C=2.5%B.缓冲液成份不连续性：凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly－C.pH不连续性：浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3D.电位梯度不连续性37/965.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳三种效应样品浓缩效应电荷效应分子筛效应38/96A.样品浓缩效应缓冲液成份及pH不连续性浓缩胶pH6.7缓冲液浓缩胶Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly解离度：

Cl>

蛋>

Glymcl

cl>m蛋

蛋>mGly

Gly凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。缓冲液样品浓缩胶分离胶39/96缓冲液成份及pH不连续性造成蛋白质样品浓缩效应示意图快离子慢离子蛋白质样品

40/96E：每厘米电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。电位梯度不连续性41/96E：每厘米电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。电位梯度不连续性42/96A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含：缓冲液成份及pH不连续性电位梯度不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶43/96A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶44/96A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶45/96A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶46/96A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶47/96B.电荷效应蛋白质样品进入分离胶后

pH增大(pH8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。因为各种蛋白质pI不一样，所载有效电荷不一样，所以质点有效迁移率不一样，形成不一样区带。缓冲液浓缩胶分离胶48/96C.分子筛效应分离胶孔径小，各分子因为大小和形状不一样，所受阻力不一样，表现出不一样泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形泳动速度最快。缓冲液浓缩胶分离胶49/96试验一离子交换层析法分离氨基酸一、试验目标学习用阳离子交换树脂分离氨基酸操作方法和基本原理二、原理氨基酸PI不一样，在同一pH下所带电荷数量和性质不一样，与树脂亲和力就有差异，所以可依据亲和力从小到大次序依次被洗脱下来。阳离子交换树脂：可供交换是阳离子；阴离子交换树脂：可供交换是阴离子；50/96离子交换层析法分离氨基酸三、操作步骤1、装柱装柱是最关键一步。重力沉降法装柱陆续不停地添加糊状物，使其形成胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当柱床体积为止。柱表面一直要保持着一层溶剂(普通l～3cm柱高)柱任何一部分绝对不能“流干”。

51/961、装柱层析柱形状，普通直径与高度比为l：15为宜。柱形必须依据层析介质和分离目标而定。待分离物质性质相近，柱越细长，则分离效果越好，但流速较慢。在样品组分并不复杂情况下，采取“矮胖柱”。52/962、平衡层析柱正式使用前，必须平衡至所需pH和离子强度，普通用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于4-6倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。本试验平衡体积：60－80mL调整流速：0.5mL/min或8-12滴/min53/963、加样上样量：0.3-0.5mL0.5mL缓冲液冲洗加样处2次注意：加样同时开始搜集加样时且勿搅动树脂床面54/964、洗脱与搜集尽可能维持衡定柱压每2分钟搜集一管，共搜集25管5、氨基酸判定每个搜集管＋1mL水合茚三酮沸水浴15min比色测定绘制洗脱曲线55/96试验二SDS分离蛋白质一、试验目标掌握SDS工作原理和操作方法二、原理不一样蛋白质含有不一样分子量，并在一定pH溶液中带有不一样电荷。但经过SDS处理后蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，所以在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质分子量大小而与其所带电荷性质无关。分子筛效应浓缩效应56/96SDS分离蛋白质三、操作步骤57/9658/961.安装膜具59/96装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口60/96盖上凹玻璃61/96将凹玻璃冲外装进槽里62/96将楔子插进，将底部插紧

63/962.配制凝胶溶液胶配制(平行电泳两块胶板)胶母液：8.4ml配胶缓冲液：13ml蒸馏水：4ml10%TEMD：0.2ml，混匀10%AP：0.2ml，混匀3.灌胶，加到顶部，往返倾斜去气泡64/96插入梳子65/96胶凝后用夹子将玻璃夹出66/96用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉67/96旋转180度，凹玻璃向里68/96将玻璃放进槽内69/96加缓冲液70/964.样品制备：

将0.5ml样品液，0.25ml10%SDS和0.25ml1%巯基乙醇于小试管中，置100℃水浴中煮沸3分钟后，取出冷却，然后，加入0.25ml上样缓冲液（0.05%溴酚兰+40%蔗糖溶液），混合。取出混合样品40微升加入样品槽，每个样品重复两个。

71/965.加样72/966.电泳73/96电泳：

接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm（约3小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。74/967.剥胶75/968染色：

考马斯亮蓝染色，详见教材

9脱色76/96凝胶（脱色之后）结果分析

1、计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基Rm值为横坐标，以对应分子量对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量标准线图。3、计算未知蛋白亚基样品分子量：依据未知样品样Rm值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。77/96试验三DNS法测定还原糖一、试验目标掌握还原糖定量测定原理和方法二、原理在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3，5－二硝基水杨酸（DNS）氧化为糖酸，加热深入产生一个红棕色氨基化合物，在一定浓度范围内，棕红色物质颜色深浅程度与还原糖量成正比，以此测定糖量。78/96三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线绘制详见教材2、还原糖制备样品：苹果滤液测定前稀释4倍其余操作见教材3、样品酸水解和总糖提取滤液测定前稀释2倍其余操作见教材4、苹果样品中总糖和还原糖测定详见教材79/96试验四多酚氧化酶制备、性质和影响原因一、试验目标学习从组织细胞中制备酶方法掌握多酚氧化酶作用、化学性质及影响原因二、原理多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，深入聚合成褐色物质；经过反应液颜色改变可大致判断反应程度，进而推测酶作用及活力大小；酶是生物催化剂，易受到各种原因影响，如温度、pH、底物浓度、酶浓度等。80/96三、操作步骤1、酶制备150g土豆（3组）150mLNaF溶液匀浆四层纱布过滤每组取50mL16g固体硫酸铵4℃30min离心15min4000r/min沉淀溶于15mL缓冲液中粗酶液81/962、多酚氧化酶作用三、操作步骤酶液邻苯二酚水现象管115d15d管215d15d管315d15d37℃水浴反应，每间隔5min振荡，观察颜色改变，共25min。82/963、多酚氧化酶化学性质三、操作步骤酶液变性剂邻苯二酚反应现象管115d15d37℃水浴10min管210d10d三氯乙酸，2min10d37℃水浴10min管315d苯硫脲结晶，5min15d37℃水浴10min37℃水浴反应，10min。83/964、底物专一性三、操作步骤酶液邻苯二酚间苯二酚对苯二酚现象管115d15d管215d15d管315d15d37℃水浴反应，每间隔5min振荡，观察颜色改变，共25min。84/965、底物浓度影响三、操作步骤37℃水浴反应，1min。酶液邻苯二酚水反应现象管15d1d39d37℃水浴1min管25d10d30d37℃水浴1min管35d40dd37℃水浴1min85/966、酶浓度影响三、操作步骤37℃水浴反应，2min。酶液邻苯二酚水反应现象管115d15d37℃水浴2min管21d15d14d37℃水浴2min86/967、H+浓度影响三、操作步骤37℃水浴反应，5min。0.8%HCl0.3%乳酸0.2%乳酸0.01%Na2CO30.5%Na2CO3酶液邻苯二酚现象管140d8d7d管240d8d7d管340d8d7d管440d8d7d管540d8d7d87/96试验五碱性蛋白酶活力测定（福林－酚试剂法）一、试验目标学习测定蛋白酶活力方法掌握分光光度计原理和使用方法二、原理酪蛋白蛋白酶酪氨酸比色测定钼蓝钨蓝酪氨酸福林－酚88/961、样品处理三、操作步骤详见教材2、比色测定4支试管，分别加入1mL酶液40℃预热2－3min空白管①平行管②③④1mL2%酪蛋白40℃，10min1mL2%酪蛋白40℃，15min2mL三氯乙酸40℃，15min2mL三氯乙酸40℃，10min过滤，分别取1mL滤