球虫试验计划

摘要：对南昌市场购买的成年鸡肠道，采用饱和盐水漂浮法检查，同时从肠内容物中获取混合球虫卵囊。在制备好的琼脂薄层的载玻片上滴加稀释适度的混合卵囊液。在显微镜下用手术刀片小心切割琼脂薄层，达到琼脂薄层上仅剩单一卵囊的严格要求。把单一卵囊包裹后经口感染雏鸡，又从感染雏鸡粪便中收集大量球虫卵囊待孢子化后再次重度感染雏鸡，掌握该球虫虫株特征及感染鸡的病理变化。结果表明：单卵囊感染雏鸡，感染率为40%；经增殖传代球虫卵囊感染雏鸡虫株，初步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫（Eimeriaacevulina）。关键词：堆型艾美耳球虫；南昌株；分离；鉴定v1材料与方法1.1材料1.1.1混合球虫卵囊。从南昌市场购买成年鸡肠道内容物获取。1.1.2试验动物。1日龄雄性雏鸡20只（购自南昌青云谱区，熊坊乡某孵化场）1.1.3试验药品。重铭酸钾（AR级），食用盐（江西盐业集团公司），琼脂条。1.1.4试验器械。生化培养箱，离心机，普通天平，内光源生物显微镜，1000W双联电炉，数码照相机，物测微尺和目测微尺，钢铝锅，500mL搪瓷杯，60mL三角瓶，60目铜筛，260目尼纶筛，眼科镊，胶头吸管，250mL烧杯。1.2方法1.2.1饱和食盐水与2.5%重铭酸钾液的制备。以量筒量取清水1000mL至钢铝锅内，电炉加热沸腾，倒入食盐380g搅拌、溶解、冷却、过滤即为饱和盐水；以重铭酸钾25g溶于1000mL清水中即为2.5%重铭酸钾液。1.2.2混合球虫卵囊检查、收集培养。取肠内容物于搪瓷缸内，加少量饱和盐水捣碎搅拌成糊状，再加65mL饱和盐水搅匀，经60目铜筛和260目尼纶筛过滤，滤液盛满60mL的三角瓶内并成凸形，静置20min后载玻片触及凸点迅速翻转，在16X16倍显微镜下观察寻找卵囊，发现大量卵囊后用胶头吸管吸取上浮液于青霉素空瓶内，兑加2.5%重铭酸钾液3mL，置30°C生化培养箱内培养24h备用。1.2.3雏鸡的饲养与管理。雄性雏鸡饲养于杀灭卵囊的纸盒内或大鼠笼内，饲喂新鲜小鸡料和洁净清水，每次做到先洗手后饲喂雏鸡，杜绝意外球虫卵囊感染。1.2.4单卵囊分离。用天平秤取琼脂条1g于250mL烧杯中，添加清水100mL，电炉加热沸腾搅拌成透明状，趁热用胶头吸管滴加胶冻液于载玻片上，待冷却后再用胶头吸管取已孢子化的混合球虫卵囊于成型的琼脂薄层上，置显微镜下逐行寻找球虫卵囊，卵囊密度控制在每个视野约有5~7个，显微镜观察下用手术刀片细心切割琼脂薄层，使琼脂薄层上仅留一个球虫卵囊，确认一个卵囊后将该小块琼脂转移置较大琼脂薄层上并包裹好。1.2.5单卵囊感染。在助手协同下打开雏鸡喙，将包裹物经口腔滴加少量清水确认喂服。共感染10只7日龄雏鸡，记录感染时间，分笼饲养。1.2.6纯种子代卵囊收集与感染。第4~8d开始每天用饱和盐水漂浮法检查雏鸡新鲜粪便，当检查有球虫卵囊时记录鸡只和排出卵囊时间并开始收集卵囊。取新鲜雏鸡粪便于500mL搪瓷杯内，杯内装有，杯内装有一定量的5°C清水。待收集一定量粪便后，将搪瓷杯内原有的清水倾去并捣碎成糊状，加350mL清水混匀，经60目铜筛及260目尼纶筛过滤，滤液分装8支离心管，每支45mL，以2000r/min离心5min；留沉淀物，取少许沉淀物与10mL饱和食盐水搅拌。搅拌后8支管归装于1支管。倒完沉淀物的7支离心管分别加10mL清水，以2000r/min离心5min，留含沉淀物离心管内的上液弃沉渣，再兑加清水至45mL处，以2000r/min离心10min，弃上清液留沉淀溶液少许，这样加清水重复离心洗净，最后将富含卵囊沉淀液从离心管中用吸管吸出移入60mL三角瓶内［7］，加等量5%重铭酸钾液置30C生化培养箱内培养。1.2.7纯种孢子化卵囊感染。胶头吸管吸取含大量卵囊液，经口感染12日龄雏鸡10只，7d后每天剖检2只雏鸡，观察肠道表面病变情况并照相。1.2.8虫株的鉴定。取少量已孢子化的球虫卵囊液于载玻片上，在16X40倍显微镜下观察发现该球虫卵囊有几种形态，有无极粒、卵囊及孢子囊残体、斯氏体等。用显微测微尺测量卵囊大小及孢子囊大小，测量100个该卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵囊形状指数，结合潜隐期及肠道表面病变部位，比对感染雏鸡病理变化堆型艾美耳球虫多在上表皮层发育，并且同一发育阶段的虫体聚集在一起；被损害的十二脂肠和小肠前段出现大量白色小斑点，引起肠道肿胀、出血。（2.4雏鸡感染球虫卵囊虫株的鉴定采用1只感染成功的雏鸡排出的卵囊，经增殖传代的球虫卵囊感染雏鸡虫株，根据其特征，初步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫（Eimeriaacevulina）。（见下表）表1鸡堆型艾美耳球虫(Eimeriaacevulina)虫株的鉴定鸡堆型艾美耳球虫卵囊特征3分析与讨论3.1虫株分离技术的意义雏鸡感染球虫在自然情况下多是混合感染，而以某一种占优势。由于不同的地理株在抗药性和致病力之间都表现出不同的抗药水平，所以为了研究的准确性,往往应用纯种株进行研究。球虫的单卵囊分离技术不但能保证所获得的卵囊为纯种，还可以进行球虫种类的鉴别和球虫纯种体系的建立。总之，建立一个便捷可行的纯种分离技术是对球虫深入研究的前提和保证［6。3.2试验体会在整个试验过程中，必须进行严格消毒，保证试验所需的无毒环境;每次离心收集卵囊时，要反复离心，以洗净盐分避免损坏虫体；离心后，应将离心管内液面逐层检查，以免由于离心时间不够或转数不足致使虫体未完全存在于某一液面层而造成卵囊的丢失；确认琼脂薄层上单卵囊时间不宜过长，否则因为琼脂干燥而影响观察球虫卵囊，当切割琼脂薄层时一定要仔细小心；感染时，尽量在雏鸡较饿时投服，避免由于其进食过多而造成投喂困难；向鸡口中滴入清水时要避免水从口中溢出，防止卵囊丢失。单卵囊感染后，鸡粪中排出子代卵囊的时间往往要迟于最短潜隐期几小时，在潜隐期之前清除粪便，一般在感染后前4d无须检查粪便，以免浪费试验用品和耗费不必要的时间和精力。3.3堆型艾美耳球虫虫株的初步鉴定试验中单卵囊感染10只雏鸡，受感染为4只。对其中1只受感染的雏鸡中的球虫卵囊，经复制增殖分离纯化获得堆型艾美耳球虫虫株。其他3只雏鸡感染的是什么类型球虫虫株还不得而知，如需掌握当地雏鸡患球虫种类，试验方法同样要逐一获得结果。窄卵圆形23.2X17.3-15.7X13.119.5X15.2无色1.28两层、光滑无抱子卵及卵囊残体有1极粒有斯氏体19〜24h十二指肠及小肠前段卵囊形状卵囊大小(|±m2)平均大小(|±m2)卵囊颜色形状指数卵囊壁残体极粒斯氏体完成孢子化时间潜隐期寄生部位球虫单卵囊分离1.3.1虫卵收集从长沙朗梨附近农户家采集病鸡粪，取一部分鸡粪漂浮镜检,可见有许多大小不一的球虫卵囊。将鸡粪装入离心管中，加水离心2次(2000r/min,10min)，倾去上清液，再加饱和食盐水离心(2000r/min,10min)1次,鸡粪渣沉于管底,卵囊漂浮于饱和食盐水表面。用经火焰消毒的铁丝环将漂浮于饱和食盐水表面的球虫卵囊打环入含25g/L重铬酸钾溶液的平皿中,保存于29°C的恒温箱中2d〜3d，得到混合种抱子化卵囊。1.3.2琼脂糖薄板的制备将2g琼脂倒入100mL小烧杯中，加水49mL,白糖1.5g,用水浴加热法加热到完全溶解即成40g/L琼脂糖溶液。取40g/L的琼脂糖溶液2mL均匀倾于干燥洁净的载玻片上,4C冰箱放置30min后，另准备一块大玻璃板,涂少许甘油,将载玻片上已经凝固的厚约1.5mm的琼脂糖板转移至大玻璃板上，于4C冰箱冻干,1d后即成琼脂糖薄片,可用于单卵囊包被。临用时再将大玻璃板上的琼脂糖薄片转移到干燥洁净的载玻片上，便于显微镜下观察。1.3.3球虫单卵囊的分离用洁净滴管吸取25g/L重铬酸钾培养的球虫混合卵囊液，滴5滴于洁净试管内,加生理盐水稀释至每滴只含1个〜2个抱子化卵囊。滴1滴于干净载玻片上，在低倍镜下观察，每个视野有1个〜2个球虫卵囊。在显微镜观察下,直接吸取卵囊。其方法是:右手持自制玻璃毛细吸管的尖端正对视野中的一个卵囊，将吸管向卵囊直伸过去，将一个卵囊吸上来。把毛细吸管中的液体滴落到铺有琼脂糖薄片的载玻片上，在显微镜下观察，确定只有一个虫卵即可。用双面刀片把载玻片上的只含一个球虫卵囊的琼脂糖薄片轻轻切割成约1.5cmX1.5cm的小方块,将此琼脂糖薄片直接将单个卵囊包埋起来，鸡球虫单卵囊分离即告成功。球种鉴别1.1兔粪的采集兔粪采集自九台市九台镇郊及春阳等乡,各乡按自然村落分散采集兔的新鲜粪便，主要以1~4月龄幼兔为主，不拘其种类，每只采集5~10g,共采集了兔粪68份,分别放入容器中，带回实验室以备检验。1.2培养方法用饱和盐水将粪泡开混匀，用60孔/寸的铜筛过滤，取漂浮上清液，以1500r/min离心10min,取其沉淀放入小试管中，加入2.5%重铬酸钾溶液，深约0.5cm,27°C恒温箱中培养。1.3种类鉴别培养12h后,做第一次检查，以后每隔8~12h检查1次，以确定子抱子形成最早时间,90h后停止培养,用显微镜观察其形态、颜色及内残体及用膜孔的有无,同时用测微尺，测量卵囊的大小，以鉴别其种类。致病性测定1.1实验动物高原鼠兔捕自中国科学院海北高寒草甸生态系统定位站地区。2010年3月和6月分别活捕72只成体（雄体46只，体重为159.90土2.37g;雌体26只，体重为146.84土3.28g）和45只亚成体（雄体21只，体重为86.43土7.23g;雌体24只，体重为77.04土4.33g）。将高原鼠兔带回实验室后，单只饲养于饲养笼内。该笼具为全不锈钢水冲式兔笼（40cmX30cmX22cm），兔笼底层有一可抽取的活动托盘，可供收集粪便用。为准确测定感染剂量对实验个体的致死率，用于实验的全部个体均为无球虫感染个体。由于在不发生重复感染的情况下，球虫感染为自限性，为此，在实验前，每天冲洗饲养笼具，并在100C干烤1h。同时收集粪便，用常规饱和盐水漂浮法检查球虫卵囊。若连续3d未从粪便中监测到球虫的个体，被认为是无球虫感染个体，备选用于实验。在实验前和实验期间，给动物提供充足的兔颗粒饲料（北京实验动物饲养中心生产）和饮水，并附加少量胡萝卜。室温和光周期均为自然环境的温度和光照。1.2混合球虫2009年6月在疑似球虫病死亡的2只高原鼠兔的肠道内容物中，用常规的饱和盐水漂浮法分离出球虫卵囊，加入2.5%的重铬酸钾溶液，置于27^土0.5°C的恒温培养箱，培养至抱子化。之后，经多次卵囊增殖，最后获得E.cryptobarretti和E.klondikensis的混合球虫卵囊（在混合卵囊中分别占69%和31%）。1.3实验处理为测定球虫对成体的致死率，将无球虫感染的成体随机分为6组，分别经口感染6000X104个/mL（An=6，早n=2）、600X104个/mL（An=7，早n=5）、60X104个/mL（An=7，早n=5）、6X104个/mL（An=6，早n=5）和0.6x104个/mL（An=7，早n=3）艾美耳混合球虫卵囊1mL。对照组以同样的方法经口灌注1mL水（An=9，早n=5）。在亚成体中，将无球虫感染的实验个体随机分为4组，分别经口感染600X104个/mL（An=5，早n=5）、60X104个/mL（An=5，早n=7）和6X104个/mL（An=5，早n=8）艾美耳混合球虫卵囊1mL，对照组个体以同样的方法经口灌注1mL水（An=5，早n=3）。在实验