第八章 核酸化学与代谢课件

第八章、核酸化学核酸的组成成分DNA的结构DNA和基因组RNA的结构核酸生物合成核酸的生物学功能核酸的分子生物学第八章、核酸化学核酸的组成成分DNA的结构DNA和基因组RN12一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递DNA是基本遗传物质一定结构的DNA产生一定结构的蛋白质，才有一定形态和生理特征，所以DNA的特定遗传密码产生的蛋白质就代表特定生物的遗传性。在遗传过程中DNA的具体作用：（1）在细胞分裂时按照自己的结构精确复制传给后代；（2）作为模板将所贮遗传信息传给mRNA。2一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递DNA是基本23RNA在传递遗传信息上的作用

1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。（二）核酸与蛋白质的生物合成DNA转录为mRNA是有选择的，tRNA和rRNA也是DNA的转录产物。（三）核酸结构改变与生物变异一切生物的变异和进化都可以说是由于DNA的结构改变而引起蛋白质改变的结果。3RNA在传递遗传信息上的作用（二）核酸与蛋白质的生物合成D34生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。１）有的由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；２）有的由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸，３）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。４）还有一些生物的遗传性状发生了突变。4生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。45（四）DNA与细菌转化一种细菌的遗传性状因吸收了另一种细菌的DNA而发生改变的现象，称为细菌的转化。（五）核酸与病变遗传性疾病是由于遗传缺陷而产生的，也就是DNA结构改变的结果。镰刀型红细胞贫血和白化病(albinism)。病毒对活细胞的侵染是寄主发生疾病，主要是由于核酸的作用。如流感、肝炎、带状疱疹、脊髓灰质炎、白血病、烟草斑纹病。5（四）DNA与细菌转化一种细菌的遗传性状因吸收了另一种56（六）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。有利：（1）改良微生物品种使产生人工难以制得的生物活性物质如胰岛素、干扰素等；（2）解决某些疾病病因和控制这些疾病。6（六）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育6第八章核酸化学与代谢课件7第八章核酸化学与代谢课件8（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物Δ脱氧核糖+H+

Δω-羟基-γ-酮戊醛二苯胺蓝色产物RNA和DNA定性、定量测定（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C9（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123410NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶C11NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式12（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核13OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH14（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPP

O--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核15各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用：ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成第二信使——cAMP各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的16OHO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHOHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHOH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTAOHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-17三、DNA的结构（一）DNA的一级结构

1)因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（basesequence)。2)通常碱基序列由DNA链的5′→3′方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。三、DNA的结构（一）DNA的一级结构1)因为DNA的脱181.双螺旋结构的主要依据（１）DNA中A＝T、C＝G。后发现：Ａ与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。（２）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。（二）DNA的双螺旋结构1953年，Watson

和Crick

提出。1.双螺旋结构的主要依据（１）DNA中A＝T、C＝G。（1920202021鸟嘌呤－胞嘧啶碱基对腺嘌呤－胸腺嘧啶碱基对21鸟嘌呤－胞嘧啶碱基对腺嘌呤－胸腺嘧啶碱基对2122磷酸二酯键22磷酸二酯键22232.双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。3.双螺旋结构的稳定因素（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（basestackingforce，由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。232.双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。23242424252525262626（三）DNA的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)→超螺旋染色体包装（三）DNA的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)→超螺27染色体包装的结构模型多级螺旋模型压缩倍数76405

DNA→核小体→螺线管→超螺线管→染色单体2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一级包装二级包装三级包装四级包装染色体包装的结构模型多级螺旋模型28四、DNA与基因组织DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。结构基因调节基因基因组四、DNA与基因组织DNATranscription2930五、RNA结构１、其基本结构同DNA，主要区别：１）核糖为：RNA；２）含氮碱基中有Ｕ，没有Ｔ。２、RNA主要有三种：１）结构RNA（rRNA)；２）信使RNA(mRNA)；３）转运RNA（tRNA).30五、RNA结构１、其基本结构同DNA，主要区别：3031313132323233主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶(D)；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TψC环含有T和ψ；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。33主要特征：3334343435六核酸的生物合成一）DNA的生物合成二）RNA的生物合成35六核酸的生物合成一）DNA的生物合成二）RNA的生3536一）DNA的生物合成（一）DNA的半保留复制36一）DNA的生物合成（一）DNA的半保留复制36371、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制5′3′5′3′5′一）DNA的生物合成-半保留DNA复制的起点和方向371、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制5′3′37382、真核生物DNA的多起点复制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn382、真核生物DNA的多起点复制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn3839（三）原核细胞的DNA复制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特点（1）不能催化从无到有的聚合反应。（2）催化的反应只能在引物的3′延伸。（3）3′接上的核苷酸决定于模板链。（4）具有5′→3′和3′→5′外切酶活性。39（三）原核细胞的DNA复制1.DNA聚合酶Ⅰ（Pol39402.PolⅡ和PolⅢPCR（多聚酶链式反应）5′5′1热变性2退火5′5′5′5′3DNA聚合酶5′5′5′5′重复1，2，3PCR反应全过程402.PolⅡ和PolⅢ40413.双链DNA复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续复制5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′复制叉上DNA合成的三种可行性413.双链DNA复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续4142（2）冈崎片段的RNA引物利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解。（3）DNA连接酶催化一条DNA链的3′末端与相邻的另一条DNA链的5′末端之间的磷酸二酯键的合成。42（2）冈崎片段的RNA引物利福酶素对RNA聚合酶有抑制作4243

其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。（4）母本DNA双链的分离DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓扑异构酶Ⅱ（typeⅡtopoisomerase）43其它功能：（4）母本DNA双链的分离DNA4344（5）DNA聚合酶的“校对”作用DNA聚合酶的3′→5′外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。4.真核细胞DNA的复制（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。（2）至少有5种DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶催化复制。生物细胞DNA复制分子机制的基本特点44（5）DNA聚合酶的“校对”作用DNA聚44455.反转录作用利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。6.DNA的损伤与修复（1）DNA损伤的各种结构变化①碱基缺失或插入②碱基改变③形成TT二聚体455.反转录作用利用反转录酶可制造与任何R4546（2）修复机制①光复活；②切除修复；③重组修复；④SOS修复（3）修复缺陷和疾病癌症；着色性干皮病；贫血病。46（2）修复机制①光复活；（3）修复缺陷和疾病癌症；着色性4647重组修复5′5′重组修复5′47重组修复5′5′重组修复5′47487.细菌的限制—修饰系统限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平头末端HpaⅠ487.细菌的限制—修饰系统限制性核酸内切酶限制性核酸内48495′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GT—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—TG—5′粘性末端EcoRⅠ495′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—4950二RNA的生物合成（一）转录转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核细胞的转录E.coli的RNA聚合酶中，α2ββ′称为核心酶。σ因子辨认模板DNA的起始位点。50二RNA的生物合成（一）转录转录产物有mRNA、t50512.真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类。3.转录过程的选择性抑制放线菌素D是原核和真核细胞RNA聚合酶的专一抑制剂。利福平是原核细胞RNA聚合酶的抑制剂。α-鹅膏蕈碱是真核细胞RNA聚合酶的抑制剂。4.转录产物的加工（1）rRNA前体的转录后加工原核细胞30S前体17S25S16S23S5S512.真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三5152真核细胞45S前体18S28S5.8S（2）tRNA前体的加工（3）真核细胞mRNA的加工52真核细胞45S前体18S28S5.8S（2）tRNA前体52537、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）方法应用局限性变形梯度凝胶电泳(DGGE)利用基因序列和长度差异分析群落多样性，适于分析较多种微生物条带序列较短，灵敏度有限，不能定量末端限制性片段长度多态性分析(T–RFLP)利用限制性位点差异分析群落多样性，快速，半定量分析限制性酶切不完全；高效高通量需要多次反复酶切克隆文库(Cloninglibrary)利用序列差异和测序可知群落中各种群系统分类；为新引物和探针设计提供信息克隆步骤耗时较长,

不适合大量分析,不适合反应器监测荧光原位杂交(FISH)原位定量和识别特定菌群背景荧光会干扰检测，探针的穿透性差会造成假阴性实时荧光定量PCR(QRT-PCR)目标基因的扩增和定量分析不适合各种基因的快速同时分析；PCR高灵敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速检测群落多样性，鉴定微生物并明确其生态作用环境样品特异性和灵敏度低，不能定量，样品处理复杂，仪器贵重537、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）方法应用局限性变53541.变形梯度凝胶电泳1）变性梯度凝胶电泳(DGGE)原理：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链解链后，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降。将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA序列。该技术可以分辨具有相同大小片段的序列差异，可以用于检测单一碱基的变化，微生物群落遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。该技术主要操作过程如下（图1）:541.变形梯度凝胶电泳1）变性梯度凝胶电泳(DGGE)原5455DGGE技术主要操作过程如下:样品预处理;

样品DNA(或RNA)提取及纯化;16SrDNA或基因片段的PCR(或RT-PCR)扩增;预实验(DGGE条件优化);

制胶;样品的DGGE分析;图谱分析;条带序列分析。55DGGE技术主要操作过程如下:样品预处理;5556DGGE过程示意图56DGGE过程示意图5657DGGE特点：GC夹板(GC–clamp)使用。为取得好的分离效果，常在DNA片段上连接一段长为30~50碱基富含GC的核苷酸序列GC夹板(GC–clamp)，可分辨相差一个碱基的序列。

DGGE技术快速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE技术对于DNA片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，DGGE法只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。DGGE技术无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。57DGGE特点：GC夹板(GC–clamp)使用。为取得5758应用举例：----变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析生化反应器微生物58应用举例：58一、取样与预处理1、微生物取样

稳定运行条件下，不同温度条件（冬季、夏季）的生物强化一体化反应器的厌氧区、好氧区填料上生物膜，HPES生物滤塔填料上的生物膜。2、样品的预处理高速离心处理生物膜样品，

用PBS（磷酸盐缓冲液）洗脱与固定生物膜。59一、取样与预处理1、微生物取样5959二、总DNA提取土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DNA。60Marker60Marker23130bp9416bp6559bp2322bp2927bp二、总DNA提取土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DN60611、反应体系：试剂50ul体系终浓度Fowardprimer（F468）2ul0.4uMReverseprimer（R468）2ul0.4uM2×2TaqMasterMix25ul1×TemplateDNA﹤1ug﹤1ug/reactionRNase-freeWaterUpto50ul三、PCR扩增611、反应体系：试剂50ul体系终浓度Fowardpri616262引物序列Primer名称序列(5'to3')碱基数细菌通用引物F468CGC

CCG

GGG

CGC

GCC

CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG56细菌通用引物R468GACTACCAGGGTATCTAATCC216262引物序列Primer名称序列(5'to3')碱基数细6263步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火55-65℃30s延伸72℃30s终延伸72℃2min变性—延伸，25-35个循环；2、PCR反应条件：63步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火5563643、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker643、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker6465三、PCR扩增DGGE紫外成像DGGE成像切胶65三、PCR扩增DGGE紫外成像65四、测序过程与结果一）测序过程1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增二

及产物回收；

2、目的片断TA克隆；3、蓝白斑筛选；4、质粒提取5、M13+/-测序（见测序图谱）66四、测序过程与结果一）测序过程6666二）测序结果DGGE条带编号测序编号V3区菌种属名14.19X1323-1198bpNovosphingobium