第二章第二节基因克隆的载体

第二章第二节基因克隆的载体第1页，课件共73页，创作于2023年2月第二节基因克隆的载体

载体的概念及特点质粒载体（plasimidvectors）噬菌体载体（phagevectors）柯斯质粒载体（cosmidvectors）第2页，课件共73页，创作于2023年2月引言载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具备多克隆位点（MultipleCloneSites，MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽;自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。具有较好的安全性，不能任意转移。第3页，课件共73页，创作于2023年2月载体的分类根据载体工作方式的不同可分为质粒载体（plasimidvectors）、噬菌体载体（phagevectors）、噬菌体-质粒杂合载体（考斯质粒）第4页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于染色体以外的能自主的复制的裸露的遗传物质。大多数质粒是闭合环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒。一质粒载体（plasimidvectors）第5页，课件共73页，创作于2023年2月

质粒的特点（1）自主复制性。质粒含有自己的复制起始位点（Origin,简称ori），有些质粒具有独立的复制子结构（Replicon），因此，质粒DNA可以自主复制，形成少则几个多则成百上千个拷贝。（2）可扩增性。在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型（Stringent）和松弛型（Relaxed）。第6页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。根据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stringentplasmid）,拷贝数为1-5；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为6-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。第7页，课件共73页，创作于2023年2月严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制由细胞内DNA聚合酶Ⅲ介导，并被质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的质粒称为严紧型质粒。松弛型质粒（Relaxed）：这类质粒的复制需要半衰期较长的DNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般可达到30~50个拷贝，所以称为松弛型质粒。第8页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入氯霉素可以抑制宿主细胞蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，松弛型质粒就能利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累积上千个DNA分子，把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。第9页，课件共73页，创作于2023年2月（3）可转移性。在移动基因mob、转移基因tra、顺式作用元件bom等因子的作用下，许多野生型质粒可以通过细胞的接合（conjugation）作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中。第10页，课件共73页，创作于2023年2月（4）不相容性。具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。细胞分裂第11页，课件共73页，创作于2023年2月理想质粒的改造与构建（1）删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源DNA的装载量；一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码质粒转移的mob基因以提高质粒的安全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。第12页，课件共73页，创作于2023年2月（3）加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）。常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄青霉素抗性基因)、Kanr(卡那霉素抗性基因)、Tetr(四环素抗性基因)、Cmr或cat(氯霉素抗性基因)、Neor(新霉素抗性基因)；第13页，课件共73页，创作于2023年2月LacZ△M15缺失第11-41位的氨基酸LacZ’N端140个氨基酸LacZ′MCS140个氨基酸+MCSLacZ1024个氨基酸LacZ△M15F质粒载体LacZE.coliLacZ△M15+LacZ′X-galLacZ△M15+LacZ′ΩDNAX-gal筛选标记基因：α-互补第14页，课件共73页，创作于2023年2月

大肠杆菌

-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的

-片段和

-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将缺失了第11-41位氨基酸的编码片段的LacZ△M15构建在F质粒上先转入大肠杆菌中，而将编码该酶N端140个氨基酸的

-片段的LacZ′基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中。当含有LacZ′基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的

-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是

-互补（

alpha-complementation）.将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）第15页，课件共73页，创作于2023年2月蓝白斑筛选第16页，课件共73页，创作于2023年2月（4）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点，即多克隆位点（MultipleCloneSite,即MCS）,便于外源基因的重组；多克隆位点(MCS)：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。（5）根据外源基因克隆和表达的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件。第17页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的分类：根据其功能和用途将人工构建的质粒分为以下几类：克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒、探针质粒、表达质粒等。第18页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的种类及用途（1）克隆质粒。用于克隆和扩增外源基因。第19页，课件共73页，创作于2023年2月（2）测序质粒。有MCS，并在MCS两端设有两个不同的引物，便于DNA测序。如pUC18/19。第20页，课件共73页，创作于2023年2月（3）整合质粒。含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞染色体基因组的特定位点上。（4）穿梭质粒。这类质粒含有两种不同的复制子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。（5）探针质粒。这类载体用来构建或筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子。第21页，课件共73页，创作于2023年2月（6）表达质粒。这类质粒在MCS的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pET系列质粒。第22页，课件共73页，创作于2023年2月第23页，课件共73页，创作于2023年2月质粒DNA的提取与纯化第24页，课件共73页，创作于2023年2月大肠杆菌基因组DNA

第25页，课件共73页，创作于2023年2月一、质粒DNA的提取第26页，课件共73页，创作于2023年2月plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA第27页，课件共73页，创作于2023年2月闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱裂解法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性第28页，课件共73页，创作于2023年2月染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性第29页，课件共73页，创作于2023年2月碱变性法这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

通过加热，尤其是在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。

线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。第30页，课件共73页，创作于2023年2月（2）

所用的试剂作用①

溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的

-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。第31页，课件共73页，创作于2023年2月③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。

SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。

第32页，课件共73页，创作于2023年2月用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤

NaAc-HAc缓冲液第33页，课件共73页，创作于2023年2月⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第34页，课件共73页，创作于2023年2月蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨

酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。第35页，课件共73页，创作于2023年2月（3）碱裂解法提取质粒DNA的步骤

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，

RNaseA（5-10mg/L）第36页，课件共73页，创作于2023年2月溶液II

破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.4NNaOH，2.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第37页，课件共73页，创作于2023年2月最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5

、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。第38页，课件共73页，创作于2023年2月这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。第39页，课件共73页，创作于2023年2月pBR3224363连接加反应液TetorAmpTet+AmpCK+2.质粒载体相关知识介绍第40页，课件共73页，创作于2023年2月质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）covalentlyclosedcircularDNA,

简称cccDNA开环双螺旋（一个裂口）opencircularDNA,简称ocDNA线状双螺旋（两个裂口）linearDNA,简称L-DNA第41页，课件共73页，创作于2023年2月三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电泳中的分离情况第42页，课件共73页，创作于2023年2月第二节基因克隆的载体引言（introduction）一质粒载体（plasimidvectors）二噬菌体载体（phagevectors）三柯斯质粒载体（cosmidvectors）第43页，课件共73页，创作于2023年2月二噬菌体载体（phagevectors）1、噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体第44页，课件共73页，创作于2023年2月1.

噬菌体的生物学特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣壳).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.第45页，课件共73页，创作于2023年2月1.

噬菌体的生物学特性

噬菌体的生长周期可分为溶菌周期（Lyticcycle）和溶原周期（Lysogeniccycle）两种类型。前者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在溶原周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。只有溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶原性细菌。在溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。第46页，课件共73页，创作于2023年2月溶原周期（Lysogeniccycle）溶菌周期（Lyticcycle）第47页，课件共73页，创作于2023年2月1.

噬菌体的生物学特性

DNA为线状双链DNA分子，长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesiveendsite）.DNA至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。第48页，课件共73页，创作于2023年2月噬菌体的头部外壳蛋白对DNA分子的包装与DNA内部的序列无关，只识别两个cos位点，同时对包装的DNA分子的大小有严格的要求：其包装范围为DNA总长的75%~105%，即36.4kb~50.9kb.第49页，课件共73页，创作于2023年2月2.DNA载体的构建（1）缩短野生型

DNA的长度，提高外源DNA的装载量。即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的前提下尽量缩小其分子长度；（2）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点；（3）灭活一些与裂解周期有关的基因，使DNA载体只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可能出现的生物污染；（4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测。第50页，课件共73页，创作于2023年2月（1）插入型载体（Insertionvectors

）

selectingrecombinantphageviainsertionalinactivationofthecIgenecI+cI-LysogeniccycleLyticcycleclearplaquescloudyplaques

噬菌体载体的分类及用途第51页，课件共73页，创作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdagt10Lambdagt10wasdesignedforthecloningofrelativelyshortDNAfragments,especiallycDNA.ThevectoracceptsEcoRIendedfragmentsupto7.6kb.InsertionoftheDNAinactivatesthelambdarepressor(genei434)resultinginclearplaques.b527isadeletionofpartoftheLambdagenome.A.....Jarestructuralgenes.第52页，课件共73页，创作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdagt11Lambdagt11canacceptfragmentsupto7.2kbinlengthinauniqueEcoRIsiteneartheendoftheE.coli

LacZgene.ThisallowsproductionoffusionproteinsfromtheLacpromoter.RecombinantphagecanthenbedistinguishedbydetectionoftheproductoftheclonedDNAusingantibodiesandalsobydetectingtheinactivationoftheLacZgeneonplatescontainingX-Gal/IPTG.nin5isadeletionoftheLambdagenome.第53页，课件共73页，创作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdaZAPThisvectorwasdesignedtoconstructcDNAlibraries.Itcanacceptupto10kbofforeignDNAinoneofsixuniquecloningsites.CloninginthesesitesresultsininsertionalinactivationofLacZallowingdetectiononX-Gal/IPTGplates.ItalsoallowsexpressionoftheproteinproductundercontroloftheLacpromoteranddetectionbyspecificantibodies.第54页，课件共73页，创作于2023年2月(续上一页)ThevectorcontainsthepBluescriptplasmid,allowingstrand-specifictranscriptionofinsertDNA.Amoreimportantfeature,however,isthatthepBluescriptplasmidinsertisflankedononesidebytheinitiatorregionofphagef1promoter,andontheothersidebytheterminatorregionofthef1promoter.ThismeansthatthepBluescriptplasmid,completewithinsert,canbeexcisedandpackagedbysuperinfection(双重感染)withphagef1.ThiscanthenbetransferredtoasuitablehostE.colistrainwheretheplasmidismaintainedandcanbeusedforsequencing.This"automaticsubcloning"greatlyspeedsuptheacquisitionofasequencefromacloneinagenelibrary.第55页，课件共73页，创作于2023年2月（2）取代型载体（Replacementvectors）第56页，课件共73页，创作于2023年2月2.

噬菌体载体（2）取代型载体（Replacementvectors）

AnotherapproachtotheconstructionofvectorsfromphageLambdaistocutoutaportionoftheDNAbyvirtueof

（依靠）apairofrestrictionsites.The49kbLambdagenomecanlose40%ofitscontentwhichcanbereplacedbyforeignDNA.Thismeansthatinsertsofupto20-25kbcanbecloned.Thesevectorsareparticularlyusefulformakinggenelibrariesfrommammaliansources.

第57页，课件共73页，创作于2023年2月

Whensuchavectoriscutbyarestrictionendonuclease,a"stuffer"fragmentisremoved,leavingrightandleftarms.ThestufferisusuallyremovedbyalcoholprecipitationandthearmsattachedtoaforeignDNAinsertpreparedusingthesamerestrictionendonuclease.

LambdaDNAhascohesiveends.Thesecanattachtoeachothertoformthecossiteofaconcatomer.

Thispolymericmoleculecanthenbepackagedintophageusinganinvitropackagingsystem.Inordertobepackaged,thedistancebetweenthecossitesmustbegreaterthan40kbandlessthan52kb.续前一页第58页，课件共73页，创作于2023年2月（2）（Replacementvectors）EMBL3and4LambdaEMBLvectorsareusefulforcloninginsertsfrom9to23kbinlength.Polylinkersarepresenteithersideofthestufferfragment.TheorderofthecloningsitesinthepolylinkerinEMBL3isreversedinEMBL4.Doubledigestionofthevectorwith,inthecaseofEMBL3,EcoRIandBamHIpreventsthere-associationofthestufferfragment(carryingEcoRIends)withthearms(carryingBamHIends).第59页，课件共73页，创作于2023年2月二噬菌体载体（phagevectors）1、噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体第60页，课件共73页，创作于2023年2月3.M13噬菌体的生物学特性

M13是线状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有6047个核苷酸的闭合环状单链DNA基因组，其单链的基因组DNA经改造后可作为单链的DNA载体。因为M13单链DNA的复制型（RF，replicativeform）是呈双链环形，此时的DNA可以象质粒DNA一样进行提取和体外操作。不论是双链还是单链的M13DNA均能感染寄主细胞。而且M13的颗粒不受包装的限制，根据DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小。

M13噬菌体将DNA正链注入寄主细胞后与单链DN A结合蛋白结合，随后以小RNA链为引物合成负链而转变成RF。第61页，课件共73页，创作于2023年2月

正链和负链出现不对称性积累：当RF积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成大量新的噬菌体颗粒。新组装的噬菌体颗粒并不会发生溶菌现象，只是从寄主细胞中挤压出去。但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长，所以仍可产生模糊的噬菌斑。在M13基因组中有一段507bp的基因间隔区，该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。3.M13噬菌体的生物学特性第62页，课件共73页，创作于2023年2月3.M13噬菌体的生物学特性＋－SSRF1-1′RFRF1-20′RFSS～20′以上ThetypicallifecycleofM13第63页，课件共73页，创作于2023年2月二噬菌体载体（phagevectors）1、噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体第64页，课件共73页，创作于2023年2月4.M13噬菌体载体

后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。载体中含有LacZ基因及位于其中的多克隆位点，所以能通过互补在X-Gal/IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了

M13mp8、9和M13mp18、19等。

这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段第65页，课件共73页，创作于2023年2月第二节基因克隆的载体引言（introduction）一质粒载体（plasimidvectors）二噬菌体载体（phagevectors）三柯斯质粒载体（cosmidvectors）

第66页，课件共73页，创作于2023年2月三柯斯质粒载