小麦生态区抗病性菌的鉴定及其核心种质的利用

小麦生态区抗病性菌的鉴定及其核心种质的利用

小麦粉末（cd.）f.sp.trime.o.sper（syn.erisyp.h.f.s.t.出版物）引起的急性疾病。近30年,由于小麦生产条件改善、感病品种种植和病菌毒力结构变异等原因,致使小麦白粉病从我国西南和东南沿海局部地区迅速蔓延至全国几乎所有麦区,发病面积从1980年的100万公顷扩展到2010年的650万公顷。鉴于白粉病对全国小麦安全生产构成了严重的威胁,我国十分重视抗白粉病的品种选育,特别是20世纪70年代引进的小麦-黑麦T1BL·1RS易位系所携带的Pm8基因被广泛利用,在一个时期有效地降低了白粉病造成的经济损失。这个易位系的黑麦1RS染色体臂上还携带与Pm8基因连锁的Yr9、Lr26和Sr36等抗条锈病、叶锈病和秆锈病基因,并且还具有高产和广适性等优异性状,对我国乃至全世界小麦抗病育种都产生了深远的影响。但是,由于生产上过度依赖Pm8基因,导致小麦白粉病菌中对该基因的毒力频率迅速上升。1990—1991年我国白粉病大流行的一个原因就是Pm8基因抗病性的丧失。在利用已知抗白粉病基因(如Pm4a等)的同时,为了丰富小麦白粉病抗源,我国还加强了抗白粉病新基因的发掘与抗病种质的创新。例如,从簇毛麦转移到小麦的Pm21基因,抗谱广、抗性强,用其培育的小麦品种已经在生产上发挥作用。本研究旨在通过苗期和田间成株期接种鉴定,研究我国不同时期国家审定(认定)的小麦品种对当前白粉病不同毒力菌株的反应;通过鉴定近年来育成品种(系)对白粉病的抗性,明确我国小麦抗白粉病育种的潜力;通过鉴定小麦核心种质的抗病性,研究我国小麦种质资源的白粉病抗性状况;同时,利用与抗病基因连锁的分子标记检测小麦品种的抗白粉病基因背景,了解有关抗病基因在我国小麦品种中利用状况。本研究的结果将有助于小麦抗白粉病育种中亲本选择、抗病资源发掘利用、抗病品种布局和白粉病田间控制策略的制定。1材料和方法1.1小麦品种及对照品种供试小麦材料包括148份近30年国家审定(认定)的小麦品种(见附表),161份2008—2010年参加国家区域试验的小麦品种或品系,以及由1160份材料组成的小麦核心种质和263份材料组成的小麦微核心种质。小麦感病对照品种为中作9504和京双16。另外,含有已知抗白粉病基因的品种或品系用于白粉病菌毒力谱的分析(表2)。1.2育苗鉴定方法具不同毒性谱的白粉菌菌株采自我国不同小麦产区,经单孢子堆分离后保存。这些菌株均能够克服Pm3a、Pm3b、Pm3e、Pm5a和Pm1+2+9基因或基因组合,但对Pm1c、Pm13、Pm20、Pm21、Pm24、Pm2+6和Pm5+6基因或基因组合均表现无毒(表1)。感病对照品种中作9504和京双16对所有测试菌株均表现高感。苗期接种鉴定方法是将待测品种播种于5×10孔的塑料育苗盘中,每孔(5cm×5cm)播种10粒。当植株第1片叶完全展开后,采用扫拂法充分接上在感病品种中作9504上新繁殖的白粉菌分生孢子,保湿24h,然后在18~20°C条件下生长,待感病对照品种充分发病时,采用0~4级标准调查第1叶片的反应型。反应型0~2为抗病,3~4为感病。成株期抗病鉴定在中国农业科学院作物科学研究所北京昌平试验站进行,每个品种播种1行,每行30粒,每隔20行播种1行感病对照品种京双16,同时在试验区播种中作9504作为接种行。春天小麦返青后,在接种行上接种混合菌株(毒力谱为V1、V3a、V3b、V3c、V3d、V3e、V3f、V4a、V4b、V5、V6、V7、V8、V17、V19、V23、V24、V25、V30、V34和V35)菌株。乳熟期采用0~9级标准调查病害的严重度,其中0级为免疫,1~2级为高抗,3~4级为中抗,5~6级为中感,7~9级为高感。1.3抗-cc-3e-pm8基因的扩增利用1RS上的ω-黑麦碱基因(ω-sec-P1:5′-ACCTCCTCATCTTTGTCCT-3′;ω-sec-P2:5′-CCGATGCCTATACCACTACT-3′)和1BS上的Glu-B1基因(011B3F:5′-GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC-3′;011B3R:011B3R5′-GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC-3′)的特异分子标记检测材料中携带Pm8基因的T1BL·1RS易位。利用已知抗病基因Pm4a(Xgwm356F:5′-AGCGTTCTTGGGAATTAGAGA-3′;Xgwm356R:5′-CCAATCAGCCTGCAACAAC-3′)和Pm21基因(Xcau127F:5′-TAGAGCAATCCAACTCACGC-3′;Xcau127R:5′-AAGGGACTGACCCATCAGC-3′)的特异分子标记检测品种中抗病基因的存在。在T3000Thermocycler多功能扩增仪(德国)上进行PCR扩增。PCR体积为25μL,其中包括15~20ng模板DNA,0.2μmolL-1引物,150μmolL-1dNTPs,10×缓冲液和1UTaq酶。反应程序为94℃预变性5min;然后进行40个循环的扩增,每个循环条件是94℃1min,55~63℃(因引物而异)1min,72℃2min;最后72℃延伸10min。采用2%琼脂凝胶电泳(Pm8)或8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Pm4a和Pm21)检测PCR扩增产物。2结果与分析2.1抗病品种及抗性根据148个国家审定(认定)品种苗期对8个白粉菌菌株的反应,对8个菌株都表现抗病的占3.4%,抗1个或2个菌株的品种占23.6%,另外13.5%的品种能够抗3~7个菌株。具多菌株抗性的品种多是近10年审定的,特别是这一时期培育的品种中,22.3%抗5~8个小种。其中石麦15、金禾9123、良星66、良星99和绵367对参试的8个白粉菌菌株都具有良好的抗性;扬麦12、偃展1号、偃展4110、新麦13、新麦19和新麦9817能够抗7个菌株;郑麦005和矮抗58对6个菌株表现抗病反应。20世纪80年代的品种都不能抗3个以上菌株,90年代的品种有少数抗3个或5个菌株。不同年代审定的品种感病频率均超过50%(图1)。参试的国家审定品种对Bg4菌株的抗性频率最高,其次为抗Bg2菌株的品种,不同年代审定的品种对这两个菌株都有一定比例的抗病品种;供试品种对其菌株的抗性品种频率在7.1%~10.7%之间(图2)。20世纪80年代审定的品种除了一小部分对Bg2和Bg4小种表现抗性之外,对其他小种都缺乏抗性。20世纪90年代审定的品种除了对E23缺乏抗性之外,对其他菌株或多或少都有一些抗病的品种,尤以对Bg4菌株的抗性频率最高(35.5%)。最近10年审定的品种抗性频率较高,对各菌株的抗性品种频率在18.1%~36.2%。特别是对毒性相对较强的菌株E20和E23也有一定频率的抗病品种。2.2他生态区的材料利用Bg1、Bg2、E09、E20和E23菌株鉴定了161份参加国家区域试验的小麦新品种(系)苗期的抗性反应。长江流域地区选育的材料苗期抗白粉病能力优于其他生态区的材料,表现在这一地区抗多菌株的品种频率高,特别是长江下游地区选育的镇05185、扬06G86、扬06G5、扬辐麦5242和宁0569,以及长江上游地区选育的MY05Z13等品系对5个菌株都表现良好抗性。黄淮麦区南部和北部地区的水地品种有一定频率的抗多菌株材料,但旱地材料抗多菌株的品种很少。在北部冬麦区的品种中,只有CA0533能够抗5个菌株,京冬24抗4个菌株。各个生态区选育的品系不抗任何参试白粉菌菌株的材料频率高达53.4%~73.7%(图3)。2.3抗病品种频率利用北京地区流行的白粉菌菌株E09对1160份小麦核心种质进行苗期接种鉴定,在地方品种和育成品种中,抗病品种的频率分别只有3.4%和4.2%,国外引进的50个品种均表现感病。根据品种的生态区分布,西南冬麦区和新疆冬麦区的抗病地方品种频率最高,分别为12.5%和11.1%,这2个麦区的育成品种抗病频率也最高,分别为8.5%和10.0%。西北春麦区的地方品种抗病频率为9.4%,但育成品种抗病频率只有2.9%。北部冬麦区、黄淮冬麦区和长江中下游冬麦区地方品种和育成品种的抗病品种频率合计只有5%左右。青藏春冬麦区地方品种的抗病品种频率为6.5%,从该区入选的4个育成品种均表现感病。华南冬麦区、东北春麦区和北部春麦区3个麦区无论是地方品种还是育成品种都没有发现抗病的品种(图4)。2.4抗病品种频率利用Bg1、Bg2、Bg4、Bg5、E05、E09和E20共7个白粉菌小种进一步研究了263份小麦微核心种质苗期对白粉病的反应,育成品种中抗病品种的平均频率高于地方品种(图5)。在育成品种中,贵农10号、兴义4号和复壮30能够抗7个菌株,偃展1号抗6个菌株,另有26.7%的品种抗1~2个菌株,泾阳60和新克旱9号抗3个菌株,66.3%的品种对所有测试菌株都表现感病。地方品种红春麦抗5个菌株,抗1~2个菌株的地方品种频率略低于育成品种,而对7个菌株全部表现感病的地方品种频率则高于育成品种。国外引进的17个品种中,大多数表现感病,只有少数几个品种能够抗1~2个菌株。在微核心种质中,有一定比例(5.9%~17.6%)的育成品种对不同各菌株表现抗性反应,其中对Bg5菌株的频率最高(17.6%)。地方品种中抗病品种频率变化在1.5%~10.0%之间,其中对Bg1和Bg2菌株的抗病品种频率高于其他菌株(图6)。虽然17个国外品种对Bg1和E09菌株没有抗病品种,但对其他菌株抗病频率在5.9%~23.5%之间。2.5良星“中抗”组在20世纪90年代以前审定的品种中没有发现成株期抗病的品种。21世纪前10年审定的品种中有12.9%表现成株期抗病。其中,良星66、郑麦9962、绵367为高抗,新麦13、偃展4110、兰考矮早八、新麦18、百农矮抗58、新麦19、良星99、石麦15和金禾9123为中抗。在国家区域试验的品种中,除了黄淮麦区旱地品种没有发现成株期抗病品种外,其他各组都有一定频率的抗病品种,其中长江流域和黄淮北部地区成株期抗病的品种频率明显高于黄淮南部地区和北部冬麦区的品种(图7)。2.6小麦品种中pm8基因的地域分布利用1BS染色体上的Glu-B1基因和1RS染色体上与Pm8基因连锁的黑麦碱基因特异引物检测148个国家审定品种中是否含有T1BL·1RS易位染色体。其中,64个品种(43.2%)具有1RS的特异扩增产物,表明携带Pm8基因,其他84个品种具有Glu-B1特异扩增产物,表明具有1BS染色体,而没有T1BL·1RS易位染色体,因此不含有Pm8基因(表1)。根据品种的审定年份,20世纪80年代的品种Pm8基因的频率为28.6%,而90年代审定的品种有44.1%的品种含有Pm8基因,21世纪审定的品种Pm8基因的频率仍然高达46.2%(图8)。利用Pm4a(Xgwm356)和Pm21(Xcau127)基因特异的SSR标记检测了国家审定小麦品种。Xgwm356能够在扬麦15、扬麦17和豫农949扩增出Pm4a的特异标记条带,Xcau127可以在石麦15、金禾9123和绵367扩增出Pm21的特异标记条带,因此这些品种可能分别含有Pm4a和Pm21基因(表1)。另外,石麦15和金禾9123还可检测到T1BL·1RS易位染色体,表明这2个品种可能具有Pm8+Pm21基因。在检测的124个参加国家区域试验的品种(系)中,在长江流域培育的品种Pm4a和Pm21的频率高于其他地区,在北部冬麦区检测到一个品种(5.3%)含有Pm21基因。在各个地区的品种中都存在Pm8基因,该基因在黄淮南部地区的品种中频率高到57.8%,在黄淮北部地区品种中的频率也达到43.5%,在黄淮旱地(25.0%)和北部冬麦区(31.6%)的品种中的频率略低于黄淮南部和北部地区的品种。长江流域应用Pm8基因相对较少(图9)。3抗病品种的选择自从20世纪70年代以来,小麦白粉病已成为全国普遍发生的流行性病害,每年都会造成不同程度的经济损失。因此,抗白粉病一直是小麦重要的育种目标。实际上,抗病品种的种植在不同阶段很好地控制了白粉病的发生和流行,降低了病害发生造成的损失。但是由于病菌群体异质性高,毒性变异频繁,因此,掌握品种以及种质资源的抗病水平有助于对白粉病抗性的持续改良。本研究发现,历史上推广的一些品种曾经表现良好的抗病性,但它们大多对当前流行的白粉菌菌株不具抗性,这主要是因为病菌毒性发生了改变。新近推广的虽然有一定频率的抗病品种,但是感病品种的频率仍高达56.4%(图1),而且具多菌株抗性(广谱抗性)的品种不多。另外,在参加国家区域试验的新品系中,仍然有超过半数的品种对测试的白粉菌菌株都不具有抗性。田间成株期抗病鉴定结果更是不容乐观,表现出较好成株期抗性的品种在近10年审定的品种和参加国家区域试验的品系中只占十分之一左右。引入新的抗白粉病基因,加强抗病性选育是十分必要的。另外,加强对非小种专化性的慢病性/耐病性研究和利用,对于培育持久抗病品种、延长抗病基因的利用时间、有效控制小麦白粉病亦具有重要意义。长江流域培育的品种抗病性较强,本研究中有多个品系能够抗不同的白粉菌菌株。根据抗病基因分子标记检测的结果,这个地区供试的品种中有多个可能含有Pm21或Pm4a基因。黄淮麦区的参试品种也有一定比例的抗病品种,不过该麦区旱地品种抗病性不强,可能由于干旱地区白粉病危害不是很严重,不作为重要的选种目标。北方冬麦区抗病的品种频率也不高。因此,一个地区抗病品种频率的高低与该区域白粉病发生危害的严重性和育种的关注程度有一定的关系。小麦核心种质中抗病材料的频率不高,主要原因在于核心种质的入选是以小麦入国家库编目中地理来源、农艺性状等数据,以及基于SSR分子标记的遗传多样性分析为基础,未涉及抗病性、抗逆性等性状数据。尽管如此,核心种质为明确我国小麦种质资源中抗白粉病基因资源状况提供了一个良好的抽样样本,根据不同生态区抗病品种分布,可以提示我们选择抗白粉病基因资源的重点区域。西南冬麦区、新疆冬麦区和西北春麦区的地方品种抗白粉病频率较高,前2个麦区的育成品种抗病的也较多。而华南冬麦区、东北春麦区和北部春麦区等3个麦区没有发现抗E09菌株的品种。这个结果与白粉病在我国的流行和发生有一定的联系。在微核心种质中,三分之二的品种对测试的白粉菌菌株都没有抗性,特别是地方品种更为敏感,只有少数几个具有多菌株抗性。鉴于目前构建的小麦核心种质主要考虑的是反映我国小麦品种的遗传多样性,并没有完全针对白粉病,因此在核心种质利用中,应选用一些抗病突出的品种作为受体亲本,有利于提高核心种质的利用效率。同时有必要构建白粉病抗性的应用核心种质,以应对生产和育种所面临的提高品种抗白粉病能力的压力。来自黑麦的Pm8基因在我国小麦抗白粉病育种中具有举足轻重的作用。在我国生产上曾经利用的T1BL·1RS易位系(如Lovrin10、Neuzucht、Predgornia2、Kovkaz和Avrora等)可追溯到少数几个黑麦来源。由于这些抗源优异的抗病性和农艺性状表现,各地竞相利用,培育了大量的品种。在本研究中,90年代品种的Pm8基因频率达到44.1%,甚至2000年以来审定的品种该基因的频率仍然很高(46.2%)。Pm8基因在参加国家区域试验的品种中也占有相当高的比例,特别是在黄淮南部和北部地区培育的品种更是这样。在先前的研究中,T1BL·1RS在黄淮麦区的频率高达59%。可见,在今后一个时期Pm8基因仍然会对我国小麦育种产生影响。实际上,Pm8基因在我国绝大多数地区都已经没有了抗性