包埋玻璃化法对扁桃休眠茎尖超低温保存的影响

包埋玻璃化法对扁桃休眠茎尖超低温保存的影响

0超低温保存试验杏仁又名巴旦杏，属于蔷薇科和桃科。它是世界著名的干果和木本油料树种。这种坚果具有很高的营养价值和经济价值。近年来我国自行培育和引进国外扁桃品种共计200多种,这些种和品种是进行扁桃遗传改良的材料,如不加以保存当地扁桃资源则很容易消失,为此有必要采取有效措施对当地扁桃种质资源进行保存。【前人研究进展】超低温保存是目前植物种质资源有效、安全、稳定、经济、长期保存的方法。包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质资源的新技术,兴起于20世纪90年代中期,具有对材料的毒害作用小,设备简单、易于操作,材料处理简单、脱水时间短且恢复生长快和成芽率高等优点,在植物种质资源的保存上具有较大的发展前景。目前该方法已成功应用在桃、苹果、李和柿等多种果树上。【本研究切入点】包埋玻璃化法在扁桃休眠茎尖超低温保存的研究尚未见报道,试验采用莎车14号扁桃休眠茎尖进行包埋玻璃化法超低温保存。【拟解决的关键问题】研究不同预培养蔗糖浓度和预培养时间、不同装载液处理时间、玻璃化液处理时间和化冻方式,对莎车14号扁桃休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存的影响,以期为新疆扁桃超低温保存提供理论和实践依据。1材料和方法1.1封蜡和贮藏试验试验材料于2013年1月中旬采自喀什莎车县1年生健壮的莎车14号扁桃休眠枝条,在枝条底部剪口处进行封蜡,用薄膜包裹后放入4℃冰箱贮藏,45d后进行试验。1.2方法1.2.1茎尖的包埋将1年生枝取出,剪取1~2cm长的枝段,用流动自来水冲洗2h,用75%无水乙醇浸泡20s,无菌水冲洗3遍,用8%次氯酸钠浸泡10min,无菌水冲洗3~5遍后剥取长约1~2mm的茎尖进行包埋。将剥取好的茎尖放入3%褐藻酸钠溶液(含0.4mol/L蔗糖和无钙离子MS)中,用胶头滴管吸取1个茎尖后滴入0.4mol/L蔗糖的0.1mol/LCaCl2溶液中,固定30min后取出,制成带一个茎尖直径为4mm左右的包埋丸,取出待用。1.2.2培训将茎尖包埋丸放入含有0、0.1、0.3、0.5、0.7mol/L蔗糖的MS培养基上,分别预培养1、3、5和7d。1.2.3个/管-4-3-菌株10个/l预培养结束后将茎尖包埋丸放入1.8mL的冷冻管中(10个/管),重复3次,用装载液(MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖)于(24±2)℃处理10、20、30、40、50和60min。1.2.4冷冻管的预处理用无菌胶头滴管吸出装载处理液,加入玻璃化溶液PVS2并在0℃冰水混合物条件下处理0、10、30、50和70min,处理后换上新鲜的PVS2,将冷冻管放入尼龙纱袋中,迅速将冷冻管浸入液氮中。其中玻璃化液PVS2是由30%甘油、15%二甲基亚砜、15%乙二醇和0.4mol/L蔗糖组成。1.2.5ms洗涤液的清洗茎尖包埋丸超低温保存24h后取出,分别放入40℃水浴锅中、0和25℃培养箱中化冻,用1.2mol/L蔗糖的MS洗涤液清洗2次,每次10min。用无菌滤纸吸去残留在茎尖包埋丸表面的洗涤液,将包埋丸接种至含MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.3mg/L培养基中,暗培养15d后,转移到正常条件下(24℃±2℃,2000lx),观察其再生情况。2结果与分析2.1蔗糖浓度对冷存率的影响不同蔗糖浓度和预培养时间对茎尖超低温保存后的存活率有较大影响,未经过蔗糖预培养的扁桃休眠芽包埋玻璃化超低温保存后,存活率为0;蔗糖浓度为0.5mol/L时,扁桃休眠芽包埋玻璃化超低温保存后存活率较高;蔗糖浓度为0.7mol/L时冻存后存活率均比蔗糖浓度为0.5mol/L的扁桃休眠芽存活率低。扁桃休眠芽包埋丸预培养时间1~7d时,在蔗糖浓度为0.3、0.5和0.7mol/L时,预培养3d的扁桃休眠芽包埋玻璃化超低温保存后存活率均比预培养1、5和7d的高,保存效果好,其中预培养3d,蔗糖浓度为0.5mol/L的扁桃休眠芽包埋玻璃化超低温保存后存活率最高,达56%。图12.2装液处理对ms培养液预培养和存活率的影响不同装载时间对包埋玻璃化超低温保存的休眠茎尖有一定影响。茎尖包埋丸经过蔗糖浓度为0.5mol/L的MS培养液预培养3d后放入装载液处理0~60min,用装载液处理包埋丸20、30和40min时,休眠芽冻存后存活率均达80%以上;随着装载时间的延长,扁桃休眠芽冻存后存活率降低。图22.3休闲芽茎尖经装载20min后,用玻璃化保护液PVS2处理不同时间。未经玻璃化保护液处理的扁桃休眠芽,冰冻后全部死亡。经玻璃化保护液PVS2处理一定时间休眠芽可以获得较高的存活率,当处理时间为30min时冻存后成活率达到或接近最大值,为45%。图32.4不同化冻方式对茎尖存活率的影响采用合适的化冻方式不仅可以避免植株细胞内的次生结冰产生,还可以减少细胞膜的破坏,为了提高茎尖包埋玻璃化超低温保存后的存活率,试验对茎尖超低温保存后采用不同方式化冻进行解冻。40℃水浴锅中快速化冻1~2min后存活率达45.37%;25℃常温中化冻时间长,存活率达4.76%;而在0℃条件下缓慢化冻存活率达到14.83%。2.5包埋丸茎尖的恢复培养将超低温保存后的茎尖包埋丸从液氮中取出,在40℃水浴锅中化冻,用1.2mol/L蔗糖的MS洗涤液洗涤后的包埋丸接种到MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.3mg/L培养基中,暗培养15d后转至光下。结果表明,包埋丸茎尖于3周后开始恢复生长并在中心部位开始膨大新叶长出。将成活的茎尖转入壮苗培养基中培养12周后茎尖分化成正常植株。由此可以看出茎尖未经过愈伤组织分化阶段直接成苗。图4,图52.6莎车18号建立超低温保存试验为了找到适合不同扁桃品种休眠茎尖超低温保存方法,提高扁桃不同品种超低温保存后的存活率,试验将莎车18号扁桃休眠茎尖采用相同的程序对其进行超低温保存,存活率达32.6%,这比莎车14号扁桃休眠茎尖超低温保存后存活率降低了12.4%,可能是由于莎车14号扁桃与莎车18号扁桃的自身生理特性造成的。3蔗糖预处理对休闲芽茎尖存活率的影响休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存取材时间受季节限制,剥芽费时,但其操作简单,经过超低温保存后直接培养成苗,避免了传统超低温保存的休眠芽嫁接后发生变异的现象,为此试验采用莎车14号扁桃休眠茎尖做试材。休眠茎尖经过整个寒冷的冬天,已形成了保护性物质和结构,相对含水率较低、其耐冻能力增加,茎尖不需经过低温锻炼,便可获得较高的存活率,是超低温保存的理想材料,这与在甜柿的休眠芽、沙生柽柳休眠芽、麻花秦艽休眠芽上的研究结果一致,可能是休眠茎尖含水量相对较低与它本身的特性有关。为了提高茎尖胞质浓度,增加抗冻力和抗脱水力,促进茎尖降温过程中玻璃化的形成,试验采用了不同浓度的蔗糖进行不同天数的预处理,试验发现预培养3d,蔗糖浓度为0.5mol/L的休眠芽包埋玻璃化超低温保存后存活率最高,达56%,而沙生柽柳休眠芽的胶球在0.8mol/L蔗糖溶液中培养1d后存活率较高,这可能是不同种类的植物休眠茎尖细胞经过蔗糖处理后,扁桃和沙生柽柳含水量和可溶性糖等保护物质不同,造成细胞渗透势和冰点变化程度不一。莎车14号扁桃休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存后存活率达45%,而取材保存一月内的甜柿休眠芽茎尖超低温保存后存活率接近100%,可能与休眠茎尖采集后保存时间有关。试验在采集莎车14号扁桃枝条45d后才进行包埋玻璃化超低温保存,长时间贮藏造成部分休眠茎尖死亡而降低其超低温保存后的成活率的原因之一。如何提高扁桃休眠茎尖超低温的存活率,仍需进一步研究。4培养基的制备采用包埋玻璃化法超低温保存扁桃休眠茎尖,将莎车14号扁桃休眠茎尖剥成1~2mm,包埋后用0.5mg/L蔗糖的MS培养基预培养3d,装