细胞基本培养技术

内容第一节玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒第二节培养操作的根本要领和要求第三节细胞培养的根本技术编辑ppt第一节

细胞培养所用玻璃及塑料

制品的清洗与消毒编辑ppt一、清洗目的：在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长有害物质包括：微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿、胶塞、塑料制品编辑ppt1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿要求：干净透明无油迹不能残留任何物质编辑ppt清洗：自来水洗，烘干泡酸自来水洗去离子水洗三蒸水洗烘干新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液〔洗液〕：浓硫酸+重铬酸钾编辑ppt浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。编辑ppt新的初次使用的玻璃器皿先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后上高压！！编辑ppt再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。原因：常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉。编辑ppt刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿外表附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿外表光泽度编辑ppt浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时配制、浸泡时应注意平安，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露局部。

编辑ppt冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。浸泡后的冲洗过程：需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备用。编辑ppt2、胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理.常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟〔以除掉培养中的蛋白质〕，自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用。编辑ppt3、塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，翻开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中枯燥！！编辑ppt二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。包装纸〔盒〕外表用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！！编辑ppt各种用品的包装器皿的包装分为半包装和全包装培养瓶两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。吸管在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。青霉素小瓶倒扣在饭盒中，全包。滤器上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。大的容器如锥形瓶，加上棉塞后半包装。枪头、EP管装在相应的盒子中，全包。手术器械放在饭盒中，全包。离心管加盖子后全包编辑ppt三、消毒、灭菌防止培养物污染可通过消毒灭菌〔将已存在的微生物去除〕灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只要求到达无传染性的目的，不要求全部杀死。编辑ppt无菌germfree：没有活菌。防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。抑菌〔bacteriostasis〕：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素编辑ppt1、消毒灭菌的方法★物理方法:湿热〔高压蒸汽〕、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。★化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。

编辑ppt2、消毒灭菌的本卷须知

★干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到160℃，保持90－120min方能杀死芽孢。注意！！消毒完毕后不可马上将烤箱门翻开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。编辑ppt★湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。注意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前，翻开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！！关闭排气阀门，开始升压，待到达所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。

编辑ppt3、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常规使用液体：消毒15磅15min。4、橡胶和塑料用品：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15min。

编辑ppt★紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台外表及桌椅等消毒。时间为30分钟－2小时左右。★过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。编辑ppt3、常用设施的消毒及灭菌培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸台面：紫外线照射、70%乙醇擦拭培养箱：新洁尔灭擦拭培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高压蒸汽灭菌培养板：紫外线照射12小时以上。培养基：过滤除菌、编辑ppt第二节培养操作根本要领和要求防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片。如“分装血清〞、“组织块贴壁初代培养〞、“传代培养〞、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。编辑ppt2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30瓦紫外线管灯，操作箱消毒20一30分钟即可；操作室空间大，需消毒30～50分钟。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果编辑ppt3、洗手和着装：原那么上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。75％酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2％的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。编辑ppt二、火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96％的不含杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。编辑ppt三、培养操作本卷须知1、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染时机。2、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。3、布局：原那么上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央(图4-1)。工作由始至终要保持一定顺序性。编辑ppt编辑ppt4、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5、培养用瓶开瓶以后，皆应保持45度斜位或平放，吸取营养液BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。编辑ppt

第三节根本培养操作技术编辑ppt一、传代培养法当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展集合，占满一切空间，此时需要进行别离培养。这一操作称传代或再培养。80%集合或刚集合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代？编辑ppt1、贴壁细胞传代编辑ppt贴壁细胞编辑ppt贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板编辑ppt++++++++++++细胞的贴附过程贴附物质带正电荷细胞带负电荷编辑ppt成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层编辑ppt材料和试剂★Hela细胞★RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗EDTA消化液〔0.02%〕★培养瓶、无菌吸液管〔5ml、1ml〕、弯头毛细滴管、废液缸编辑ppt图5-6消化法传代培养步骤编辑ppt【程序】(1)吸除培养瓶内旧培养液；(2)向瓶内参加EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限；(3)置温箱中2～5分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；(4)吸除消化液编辑ppt(5)用吸管吸取营养液〔已经参加双抗并调好pH值〕参加培养瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；(6)计数板计数后(如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。编辑ppt2、悬浮细胞的传代培养

编辑ppt悬浮生长型细胞编辑ppt编辑ppt材料和试剂★HL-60细胞★RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗★培养瓶、无菌吸液管〔5ml、1ml〕、弯头毛细滴管、废液缸编辑ppt二、操作步骤l、选生长良好的HL-60细胞一瓶轻轻参加等量的生长液。2、用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀悬浮然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。3、如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。编辑ppt二、初代培养法

意义：初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，在一定程度上能反映体内状态。初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好；初代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。编辑ppt

1、原那么：幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。〔一〕取材编辑ppt本卷须知：取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1立方厘米左右的小块，置于培养液中，4℃贮存；存放时间不宜超过24小时。从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500~1000单位／毫升的青、链霉素BSS液，漂洗5~10分钟后再做培养处理。编辑ppt1、鼠组织取材各种组织取材编辑ppt2．取皮肤：人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切取l~2cm2皮肤，即满足培养要求。取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用75％酒精擦拭消毒2~3次(勿用碘酒)。取材方法可按如下两种方法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径2~3毫米小片，深度以创面微见血迹为度；二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤外表，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。编辑ppt3．取体液：血液白细胞是常用的培养材料，一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢复很快不易感染。从手指取2~3滴血即够一次培养，血用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸出血后拔掉针，立即把血注入无菌容器中备用。取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关科室，按不同手术规程取材。编辑ppt〔二〕组织的别离目的：为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能到达单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种；编辑ppt1．离心别离法培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法别离。一般用低速500~1000转／分速度，离心5~10分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。编辑ppt淋巴细胞别离法原理：淋巴细胞分层液(LyphocyteSeparationMedium)效果很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分层液适用于别离血中淋巴细胞。(1)取抗凝血假设干毫升；(2)按1:1参加无菌分层液(滤过除菌)后，800~1000转离心；(3)无菌别离出白细胞(白细胞位于红细胞上层，呈微白色)；(4)BSS漂洗1~2次，可用于培养或其它实验。注意：如用动物血(如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为l.080左右，需用相应比重的分层液。编辑ppt2．机械分散法：切割别离法：在进行组织块培养时，可采用剪切法，一般多剪切成1mm3大小的块。具体操作如下：编辑ppt无菌切取1cm3组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪(剪柄较长为好)伸入容器中，反复剪切组织至1mm3大小为止(成糊状)。然后用吸管吸取Hanks液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并再补加3~5毫升Hanks液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、余下组织块即可用于培养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。编辑ppt压挤法编辑ppt编辑ppt3．消化别离法：组织消化法是在把组织剪切成较小体积的根底上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后成细胞团或单个细胞，然后参加培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。编辑ppt1．消化培养法(单细胞培养〕(三)原代细胞培养类型编辑ppt(1)准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；(2)处理组织：把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如疑心组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30～60分钟；(3)剪切：用眼科剪把组织块切成2～3毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；编辑ppt(4)消化：参加比组织块总量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置)37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。编辑ppt(5)别离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化)；低速(500～1000转／分)离心消化液5分钟，吸出上清，参加适量含有血清的培养液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再参加培养液)；编辑ppt(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH要求在7.2～7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整；(8)培养：置入36.5度温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。编辑ppt编辑ppt2、组织块培养法:

编辑ppt编辑ppt【程序】(1)剪切：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗2～3次以去掉外表血污，吸净Hanks液，用眼科剪反复剪切成lmm3块为止；(2)摆布：用弯头吸管吸取假设干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距离为0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20～30块；(3)轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱2小时左右(勿超过4小时)，使小块微干涸；编辑ppt(4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组织小块附着尚不牢，注意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。编辑ppt三、细胞计数一、原理

细胞计数结果以细胞数/毫升表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。

用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反响，也可测定细胞相对数和相对活力。

编辑ppt二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管

2、试剂：0.4％台酚兰(台酚兰0.4克加双蒸水至100ml)3、材料：细胞悬液(细胞悬液的制备：用毛吸管吸5滴细胞悬液到一小试管中，参加1滴台盼蓝染液〔0.4％〕或苯胺黑，混匀，静置2－3min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样参加染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。)编辑ppt三、操作步骤

1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：〔细胞悬液的细胞数〕/ml＝〔四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104/ml编辑ppt说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板每一个大格的体积为：1.0mm〔长〕×1.0mm〔宽〕×0.1mm〔高〕＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。四、细胞计数要点1.要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否那么影响计数准确性。

编辑ppt3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时屡次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；4.数细胞的原那么是只数完整的细胞，假设细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，那么只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否那么要重新计数。

编辑ppt五、初学者易犯的错误：

1.计数前未将待测悬液吹打均匀。

2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。编辑ppt细胞计数原理编辑ppt编辑ppt四、细胞冻存1．原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，最终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中参加保护剂甘油或二甲基亚矾(DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可防止上述现象的发生。当前最常用的保护剂仍为甘油和DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5％~15％之间，常用10％。编辑ppt2．要点:为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法。编辑ppt各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，另外用什么防护剂适宜和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20％~30％甘油中很好。原那么上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。编辑ppt编辑ppt[程序](1)细胞处理：选对数生长期细胞；收集细胞24小时前换液一次；(2)冻存液：先用培养液9分+DMSO1分(或甘油)配成10％的DMSO冻存液；按按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达107／ml(一般用4瓶细胞)，(4)分装：分装入无菌冻存管中，每管加1.5毫升细胞悬液；(5)封口：拧紧冻存管盖，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察；编辑ppt〔6〕入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；(7)冻存：当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工方法：4℃1h、-20℃2h、85℃1h、从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按-1℃~-12℃／分钟速度，在30~40分钟内，下降到液氮面，再停30分钟后，直投入液氮中。注意：①操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮伤人；②细胞注入安瓶中后一定封严，最好使用塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。编辑ppt五、冷冻细胞复苏方法

编辑ppt[程序](1)从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因末封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅速气化而发生爆炸(力量有限)，因此应带防护眼镜和手套；(2)迅速放入盛有36~37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内溶解；(3)用70％酒精擦试消毒后，净化台上翻开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮；编辑ppt(4)低速离心(500~1000转／分)5分钟。(5)去上清，参加培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10倍或1：20倍的稀释(细胞数／毫升)；一般每瓶细胞接种浓度为5×105／m1，因此冻存密度应到达107／ml，在稀释20倍时，仍能保持5×105／ml数量。编辑ppt六、细胞运送一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；编辑ppt二为充液法：(1)选生长状态良好的细胞，待达80％或90％集合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要到达培养瓶的颈部(过满易污染)，保存少许空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；(2)妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；(3)到达后，倒出大局部培养液，保存正常量，置37℃培养，次日传代。编辑ppt七、收到细胞的处理方式1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，假设有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。2.冷冻细胞解冻程序:1〕依据细胞株数据单指定之根底培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。2〕FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。

编辑ppt3〕将培养基置于37°C水槽中回温，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化后，回温后喷以