细胞培养技术概述

细胞培养技术概述一、概念■细胞培养技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。■细胞系原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。类型：有限细胞系(FiniteCellLine)、连续细胞系或无限细胞系(InfiniteCellLine)、肿瘤细胞系或株。■原代培养定义：直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。优点：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。■传代原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。二、目的与用途■1、科学研究药物研究与开发新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。基础研究：药物作用机理、基因功能疾病、发生机理■2、生物制药疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗（多肽疫苗）等。基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等诊断用和药用单克隆抗体生产细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等三、细胞培养技术的主要优点研究的对象是活的细胞研究的条件可以人为的控制研究的样本，可以达到比较均一性研究的内容便于观察、检测和记录研究的范围比较广泛研究的费用相对较经济。四、细胞培养技术的主要缺点■人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同：当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.■与体内主要不同：相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响■主要表现：失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显,细胞趋向单一化；■提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。五、所需仪器■生物安全柜（无菌室）■CO培养箱2■CO气瓶，CO减压阀22■数显水浴锅■离心机■倒置显微镜六、实验用品■1.细胞培养实验用品均为无菌。■2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。■3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml■4.塑料离心管：15ml,50ml,可依实验需要而选择适合材质之离心管。■5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。■6.玻璃试剂瓶：100ml,250ml,500ml,1000ml七、无菌操作基本技术■1.紫外灭菌：实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟，以75%擦酒精拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。■2.无菌操作：无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。■3.安全取用：小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。■4.注意安全：工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。■5.定期检测下列项目：CO2钢瓶之CO2压力CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。5.4水浴锅可添加消毒剂，定期更换水槽的水。八、细胞培养的基本条件■无菌条件细胞培养的无菌环境无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。（使用前）紫外照射（1小时）每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。■细胞生长条件1、细胞的营养需要合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。细胞培养基的种类很多，按其来源分为天然培养基、合成培养基和无血清细胞培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基）。天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。合成细胞培养基是化学成分明确的培养基，组分稳定，由于天然培养基的一些营养成分不能被合成细胞培养基完全代替，因此一般需在合成细胞培养基中添加5%〜10％的小牛血清。但小牛血清的成分复杂，这对培养产物的分离纯化和检测会带来一定的不便。无血清细胞培养基（serumfreemedium,SFM）是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成成分不含有任何动物组分。按照其组分分类，还可以分为无动物组分无血清细胞培养基和化学限定无血清细胞培养基，前者组分中可能含有某些植物来源成分，而后者完全由化学成分明确的组分组成。其中，无动物组分无血清细胞培养基是目前在生物制药行业中应用最广泛的，它提高了细胞培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦。2、细胞的生存环境温度人体细胞培养的标准温度36.5°C±0.5°C气体:02CO2pH:7.2-7.4细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6。每种细胞都有其最适pH值。渗透压细胞通常可耐受260mOsm/kg320mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。无污染无毒九、体外培养细胞的生长方式及分型1、贴壁型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下几型：■成纤维型细胞名称：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似形态：呈梭形、多角形、星型、扇形或不规则型生长。生长特点：呈现放射状、火焰状、旋涡状或栅栏状等走行形式。比较疏松，不紧靠连成片。■上皮型细胞形态：扁平不规则多角形特征。生长特点：胞间相互衔接，细胞紧密相连，呈现铺路样。很少脱离细胞群单个活动■游走细胞型名称：具有类似巨噬细胞样形态特征的细胞。生长特点：散在生长，一般不连成片。呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向不规则，且外形不断变化。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大相互连接成片后，可呈类似上皮型或成纤维细胞形态。2、悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便（不需消化），易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长（尤以正常细胞）十、每代贴壁细胞的生长过程■游离期■贴壁期■潜伏期■对数生长期■停止期（平台期）十一、细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1、 悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2、 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3、 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。首次传代注意事项■细胞生长密度不高时，不能急于传代■原代培养的贴壁细胞需控制消化时间■吹打已消化的细胞应减少机械损伤■首次传代时细胞接种数量要多一些■首次传代培养的pH应偏低些■小牛血清浓度可加大至15%〜20%左右■接种数量为5X104〜8X105个/ml十二、细胞计数■培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。■细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同■血细胞计数器：手工计数细胞■Coulter计数仪：人工计数■细胞计数要点：遵循数上不数下，数左不数右。悬液中细胞数目不低于104个/ml,最适浓度为50-100X104细胞/ml。细胞悬液中的细胞要分散良好，否则影响计数准确性。操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。十三、活力测定■原因：任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。■定义：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力■意义：组织中分离细胞，了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞了解冻存和复苏的效果。■测定方法台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色四唑盐(MTT)比色法MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。十四、细胞冻存和复苏■冻存主要目的：保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。减少细胞被微生物污染的危险性。减少细胞之间交叉污染的危险性。减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。降低人力和物力。■细胞冻存方法预先配制冻存液。取对数生长期细胞,经胰酶消化后，加入适量冻存液，吹打制成细胞悬液(1X1065X106细胞/ml)。加入1ml细胞悬液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。■细胞复苏方法

低速离心 ,去上清加新培卓 养液培养37-38度

恒温水浴10倍以上培养液中培养观察37-38度

恒温水浴10倍以上培养液中培养观察培养4h左右换新培养液十五、细胞培养的污染和检测■细胞污染的种类细菌、酵母菌、霉菌和病毒■污染源无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之细胞细菌和真菌的污染和检测■肉眼直接观察法■培养检查法■显微镜观察法■支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因：支原体大小0.1—0.8um,无细胞壁，可透过一般过滤膜(0.22-0.45um)；支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；研究或操作人员忽略污染问题；已受污染的细胞；已受污染的培养基、血清。支原体的检测：1、Hayflick培养基直接培养法原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来（例如M.hyorhinis）。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。2、DNA荧光染色法原理：利用荧光染剂检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine（A-T）rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55〜80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicatorcell，例如Verocellor3T3cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。特点：简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。3、 PCR方法原理：利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasmaDNA。所用之p