第3章 灭菌与空气净化

第一次作业1、什么是发酵？什么是发酵工程？2、简述典型好气性发酵的一般工艺流程第二次作业1、菌种选育具体有哪些方法？2、菌种保藏的原理是什么？有哪些方法？3、设计一个从自然界筛选产淀粉酶的高温菌的实验方案，详细说明主要步骤。第三次作业1、种子扩大培养的一般流程是怎样的？2、影响种子质量的因数有哪些？第3章灭菌与空气净化3.1灭菌灭菌：用物理或化学方法杀死或除去物料或设备中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死空气、容器内外及环境中的微生物，一般只能杀死营养细胞。除菌：用过滤的方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。3.1.1发酵工业常用的灭菌方法1、干热灭菌法2、湿热灭菌法3、射线灭菌法4、化学药剂灭菌法5、过滤除菌法3.1.2湿热灭菌原理1、微生物的热阻致死温度：杀死微生物的极限温度致死时间：在致死温度时，杀死全部微生物所需的时间热阻：指微生物在某一特定条件（温度和加热方式）下的致死时间

表3-1几种微生物对湿热的相对抵抗力微生物名称大肠杆菌细菌芽孢霉菌孢子病毒相对抵抗力130000002～101～52、微生物的热死规律——对数残留定律实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：

（1）N：任一时刻的残留的活菌数（个）t：灭菌时间（min）K：反应速率常数（min-1）取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得式中：N0为开始灭菌时原有活菌数（个），

Nt为经过t时间灭菌后的残留菌数（个）

K为反应速率常数（min-1）由上式可知灭菌时间取决于污染程度N0、灭菌程度Nt和K值。①一般只考虑细菌的芽孢作为计算依据。②如果要求达到彻底灭菌，即Nt＝0则所需灭菌时间t∞，这在实际生产上不可行。在实际设计时常采用Nt＝0.001，即在1000批次灭菌中有一次失败。③反应速率常数K是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，K值越小则微生物越耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下，K值不同。灭菌温度越低，K值越小；灭菌温度越高，K值越大因此提高灭菌温度，K值增大，灭菌时间显著缩短。3.1.3培养基的灭菌1、培养基灭菌温度和时间的选择在化学反应的一级反应动力学类型中，当其他条件不变时，反应速率常数与温度的关系可用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程表示：

由于杂菌死亡属一级动力学反应，大部分培养基营养成分的破坏为一级分解反应。在灭菌时，当温度由T1升到T2，灭菌速率常数K和培养基成分破坏速率常数K’都变化。灭菌速率常数K值在T1、T2时分别为：将两式相除并取对数得：

(1)

同样，灭菌时培养基营养成分的破坏也可得类似关系：

(2)将式（1）和式（2）相除得：由于杀死细菌芽孢的活化能E大于营养成分破坏的活化能E‘，因此>，即随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于营养成分破坏速率常数增加的倍数，也就是说温度升高，杂菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间，并减少培养基营养成分的破坏，这就是通常说的“高温短时灭菌法”。如将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌，当温度维持118℃加热15min，可杀死99.99%的细菌芽孢，维生素B2破坏率为10%；而在120℃时加热1.5min，细菌芽孢死亡率仍为99.99%，而维生素B2破坏率为5%。2、培养基的灭菌方法（1）分批灭菌也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程。在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。（2）连续灭菌也称连消，指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入空消后的发酵罐的灭菌法。

连续灭菌的流程有3种：（a)喷射加热连续灭菌流程(b)喷淋冷却连续灭菌流程（c）薄板换热器连续灭菌流程（3）固体培养基灭菌固体培养基也和液体培养基一样，要先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差不易翻动，吸水加热容易成团，冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容器。转鼓以0.5～1r/min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。3、连续灭菌与分批灭菌的比较（1）连续灭菌的优缺点优点保留较多的营养质量容易放大较易自动控制；糖受蒸汽的影响较少；缩短灭菌周期；在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。缺点设备比较复杂，投资较大。（2）分批灭菌的优缺点优点设备投资较少染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。4、影响培养基灭菌的其他因素影响培养基灭菌除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌时间和温度外，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。（1）培养基成分油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。（2）pH值培养基pH为6.0～8.0时，微生物耐热性好，pH＜6.0时氢离子容易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡，所以培养基的pH值越低，灭菌所需时间越短。（3）培养基的物理状态颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。当培养基中有直径大于1mm的颗粒物则明显影响灭菌效果，蒸汽很难渗透到颗粒内部，称为“灭菌不透”，应过滤除去。（4）泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。（5）微生物细胞的含水量含水越多，微生物越易死亡（6）微生物细胞的菌龄菌龄越老则越不易死亡（7）空气排除情况空气排出越彻底，微生物越易死亡5、灭菌时间的计算（1）分批灭菌时间的计算【例3-1】

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速率常数为1.8min－1。求灭菌失败机率为0.001时所需的灭菌时间。有一发酵罐，内装80m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢数为1.25×107个，大肠杆菌为5×107个，霉菌为2.5×107个121℃时灭菌速率常数为0.0287s－1。试求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。（2）连续灭菌时间的计算【例3-2】若将例3-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，此温度下灭菌速率常数为15min－1，求灭菌所需的维持时间。3.2空气净化一、空气净化的方法1加热灭菌2静电除尘3介质过滤除菌二、空气过滤除菌的原理和介质按照过滤除菌机理不同，过滤除菌分为：绝对过滤：尘埃或M直径＞过滤介质孔径相对过滤：尘埃或M直径＜过滤介质孔径这种相对过滤又称为深层介质过滤。1、空气过滤除菌的原理（1）布朗扩散作用（2）拦截作用（3）惯性碰撞（4）重力沉降（5）静电吸引①当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用，除菌效率随气流速度增加而上升②当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用，除菌效率随气流速度增加而降低③当气流速度中等时，拦截起主要作用④当气流速度过大时，已被捕集的微粒又