mw-1菌株苯酚降解菌的分离筛选

mw-1菌株苯酚降解菌的分离筛选

苯是提取、化工、石油、塑料、纺织、制药等废水中的主要污染物。它也是寄生虫引起的各种合成化合物的中间代谢物。大量酚类物质及其衍生物在土壤和水体中的排放和积累导致了生态环境的日趋恶化,许多国家已将其列入环境优先控制污染物的黑名单中。近年来,国内外在苯酚生物降解方面进行了广泛的研究,已鉴定具有降解苯酚能力的微生物有细菌、酵母菌等。利用培养优势菌群的微生物法降解酚类化合物因其投资少、处理效率高、运行成本低、无二次污染等优点而得到越来越广泛的应用。本试验从沈阳某废弃煤气厂土壤中分离筛选到一株高效苯酚降解菌,并对其降解特性进行了研究,旨在找到对酚类化合物具有高效降解能力的优势菌株,为今后的进一步研究及含酚废水的生物处理奠定基础。1材料和方法1.1细菌的来源沈阳某废弃煤气厂土壤1.2kh2po40/3驯化培养液:为无机盐溶液中添加一定浓度的苯酚配制而成。各种无机盐的含量为(g/L):KH2PO40.5;K2HPO40.5;MgSO4·7H2O0.2;CaCl20.1;NaCl0.2;NH4NO31.0。分离及保存培养基:为含200mg/L儿苯酚的牛肉膏蛋白胨固体培养基。1.3苯酚最佳添加量的确定取一定量的菌源土壤加入到苯酚浓度为300mg/L的驯化培养液中,室温通气富集培养,定时取样测定苯酚浓度,至苯酚完全降解后,再加入新的以苯酚为唯一碳源的驯化培养液进行驯化培养。连续驯化20d左右,苯酚浓度从300mg/L增至2000mg/L。定时取样采用稀释涂布和划线的方法在分离培养基平板上分离筛选能以苯酚为唯一碳源和能源的降解苯酚菌株。1.4苯含量测定采用4-氨基安替吡啉直接分光光度法。1.5苯酚初始浓度的测定苯酚降解率/%=[1-(C1+C2)/C0]×100%式中:C0-苯酚起始浓度mg/L;C1-反应后苯酚浓度,mg/L;C2-挥发的苯酚浓度,mg/L。1.6菌悬液最大吸收波长测定在无菌操作下,用接种环挑取目的菌菌苔一环接种于50mL、苯酚浓度为200mg/L的无机盐培养液中,在温度为30℃,转速为120r/min的条件下振荡培养24h后,将培养液离心倾去上清液后,加入适量的无机盐培养液制成一定浓度的菌悬液,用722-2000型分光光度计对菌悬液进行检测,确定其最大吸收波长为380nm。经测定实验用种子液为OD380=0.500。实验过程中取培养液在380nm下测定其OD值表示菌体生长情况。1.7苯酚降解菌生长特性的测定主要考察pH值、温度、通气量、接种量、苯酚初始浓度及外加碳源对MW-1苯酚降解菌生长及降解性能的影响。基本实验条件为:取苯酚浓度为400mg/L的无机盐培养液50mL于250mL三角瓶中,按20%的接种量接入OD值为0.500种子液,以初始培养液(未接菌悬液时)为空白参比,用稀HCl或NaOH调节培养液初始pH值,在30℃,120r/min的摇床上振荡培养,6h后测定培养液中苯酚浓度及苯酚降解菌生长的OD值。每一条件做两个平行,计算其菌体生长的平均OD值和平均苯酚降解率。2结果与讨论2.1苯酚降解菌的分离与鉴定用以苯酚为唯一碳源的无机盐培养液对煤气厂土壤进行驯化,在驯化液苯酚浓度为1300mg/L时,从驯化液中分离到1株苯酚降解菌,编号为MW-1。该菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上30℃恒温培养48h后,其菌落特征:菌落较小,1～2mm,黄色圆形突起,边缘整齐,光滑不透明,粘稠无味。通过革兰氏染色,油镜观察该菌为革兰氏阳性球菌,细胞多个堆在一起或单个存在。菌种尚待鉴定。该菌株对苯酚的最大耐受量为1600mg/L。2.2初始ph值对菌株降解苯酚的影响为了确定MW-1菌株降解苯酚的最佳pH值,在改变无机盐培养液的pH值后按1.7的基本实验条件进行苯酚降解实验,考察pH值对MW-1菌株的生长及降解苯酚情况的影响。6h后实验结果见图1。从图1可知,菌株MW-1的生长与苯酚降解是同步的。在初始pH值小于7.0时菌株MW-1的生长和苯酚降解率随pH值的增大而缓慢升高,pH=7.0时其苯酚降解率最高达85.7%,此时菌体浓度也为最大(OD值为1.011)。在pH值大于7.0后,尤其是在pH值大于7.5以后,随着pH值的增大,菌株MW-1的生长和苯酚降解率却呈迅速下降之势。在pH6.0～7.5时,苯酚降解率与菌浓的变化较小,菌株的平均降解能力最强,均可达80%。以上结果说明,MW-1菌株在偏酸性至弱碱性条件下都可较好的生长,并具有较好的降解苯酚的能力。其最佳生长及降解苯酚的pH值为7.0。2.3mw-1菌株对苯酚降解菌体浓度的测定在pH值为7.0时,调节摇床温度分别为20,25,30,35,40°C,其它条件同1.7,6h后测定培养液中苯酚浓度及苯酚降解菌的菌体浓度。图2表明,MW-1菌株在培养温度低于30°C时,随着温度的升高,苯酚降解率逐渐升高,菌浓也逐渐增大;在30°C时,其苯酚降解率最大达86.1%,此时菌体浓度也达到最大值1.019。在培养温度高于30°C后,随温度的升高,MW-1菌株的生长繁殖活动减弱,而且其降酚率也逐渐减小。菌株MW-1的最佳生长温度为30°C。2.4装液量对苯酚降解的影响一般来说,通气量是好氧微生物生长的重要影响条件。采用改变装液量来改变摇瓶的通气体积,以达到不同通气量的目的。在pH为7.0,温度为30℃的条件下,6h后测定培养液中苯酚浓度及菌体OD值。结果见图3。从图3可知,MW-1菌株的生长和对苯酚的降解均随装液量的增加即通气体积的减小而缓慢减小。在装液量为30～50mL时,菌浓OD值均大于1,苯酚降解率在87%以上。在装液量为100mL时,苯酚降解率达53%以上。2.5接种量对苯酚降解率的影响投菌量对处理体系菌体浓度、处理效果及处理效率有直接的影响。在装液量50mL,pH7.0,温度30℃,摇床转数120r/min的条件下,改变接种量,6h后测定培养液中苯酚浓度及菌体OD值。结果由图4可以看出,接种量在5%～20%之间,MW-1菌株的菌浓与苯酚的降解率均随接种量的增加而快速增大,菌体增长速度较快,降酚率从18.68%增大到87.24%;在接种量大于20%时,菌体生长量及苯酚降解率基本稳定。以上结果说明,适当增加投菌量,有利于快速去除水体中的苯酚。而过多的增加投菌量并不能有效的提高其处理速率反而增加了处理成本。用不同培养时间得到菌体作为种子液,研究对苯酚的降解性能及菌体生长情况。实验结果表明:当种子液为培养24～60h时的菌体时,6h的苯酚降解率及菌体生长基本达到稳定,苯酚降解率可达83.7%以上,OD值在0.980左右;当以培养48h的菌体为种子时,6h的苯酚降解率与菌体生长均达到最大值,分别为86.1%和1.008。以培养12h的菌体为种子时,6h的苯酚降解率仅为24.1%,菌体OD值为0.313,而种子液为培养时间大于60h的菌体时,苯酚降解率及菌浓都呈明显下降趋势。培养时间小于24h时或大于60h的菌体不适宜作种子,此时菌体的增殖及苯酚降解性能均较差。2.6苯酚对菌体生长和苯酚降解的影响调整苯酚初始浓度分别为200,300,400,500,600,700,800mg/L,接种量为20%,其它条件同2.5,分别在3h和6h后测定培养液中苯酚浓度及苯酚降解菌的菌体浓度,结果见图5。从图5可知,苯酚浓度对菌株MW-1的生长繁殖及降解苯酚的性能影响较大。在苯酚浓度低于400mg/L时,无论在3h还是在6h之内,菌体生长随苯酚浓度的增加而迅速增加,苯酚降解率随苯酚浓度的增加缓慢下降(由苯酚浓度的增加所致),但其对苯酚的降解率在3h和6h内分别可达72%和85%以上。当苯酚浓度在500mg/L时,3h时对苯酚的降解率仅达32.9%,菌体OD为0.611。但当苯酚浓度大于500mg/L时,3h时菌的生长变化不大。而6h后菌体生长及苯酚的降解率随苯酚浓度的增加呈缓慢下降趋势,6h后500mg/L时苯酚的降解率达75.4%。由此可以看出,苯酚对该菌有一定的毒性,高浓度时抑制菌体的生长和繁殖,影响菌体对苯酚的降解。另外,菌体对苯酚初始浓度在400～500mg/L之间的变化最为敏感。该菌对苯酚浓度的变化也有一定的适应性,在苯酚浓度大于500mg/L或接种6h后,苯酚浓度对菌体的影响就不很明显。因此在处理高浓度苯酚废水时,可通过适当的预处理如稀释或延长处理时间可有效提高苯酚降解效率。2.7附加葡萄糖对菌株降解苯酚的能力的影响本实验设计了通过外加不同浓度的葡萄糖,考察在有其他碳源存在,装液量50mL,pH7.0,温度30°C,摇床转数120r/min,接种量20%,苯酚初始浓度400mg/L的情况下,MW-1菌株的生长及降解苯酚的情况。结果见图6。从图6可知,外加葡萄糖对MW-1菌株的生长及降解苯酚能力均有一定的抑制作用,这一结果与现有报道不同。文献均表明外加碳源对菌体的生长无影响或可促进其生长,但对苯酚的降解影响很大,降解率明显下降。而菌株MW-1在外加葡萄糖浓度为100mg/L时,降酚率由不加葡萄糖时的86.5%降至81.9%,菌体OD值也从1.021降至0.999。在有300mg/L葡萄糖存在的情况下菌株对苯酚的降解率还在70%以上,菌体OD值为0.926。当葡萄糖浓度增加到600mg/L时菌株对苯酚的降解率仍可达58%以上,菌体OD值为0.786。说明该菌株在有外加碳源存在时仍能以苯酚为碳源进行生长,这对于含其他碳源污染物的含酚废水的处理无疑是非常有利的。这一现象有待于进一步研究。3外碳源对菌株对苯酚的降解能力(1)用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化,从驯化液中分离到1株苯酚降解菌,编号为MW-1,该菌株最高可耐受1600mg/L的苯酚。该菌为革兰氏阳性球菌,细胞单个或多个堆在一起。(2)对该苯酚降解菌降解性能研究表明:该菌具有较强的苯酚降解能力,在苯酚浓度小于400mg/L,温度30°C,pH