人教版生物选修一专题5《DNA和蛋白质技术》课件

专题5DNA和蛋白质技术专题5DNA和蛋白质技术1DNA的粗提取与鉴定课题1DNA的粗提取与鉴定课题12一、基础知识1、DNA粗提取的原理（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为

0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。：DNA的溶解性和耐受性（3）蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性。洗涤剂可以瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。一、基础知识1、DNA粗提取的原理（1）DNA在NaCl溶32、DNA的鉴定原理：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。注意:二苯胺要现配现用,否则会影响鉴定结果。二、实验设计1、实验材料的选取原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。2、DNA的鉴定原理：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染42、破碎细胞，获取含DNA的滤液在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。注意：2、破碎细胞，获取含DNA的滤液在鸡血细胞液中加入一定量5高中生物3、去除滤液中的杂质方案一原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方法：用NaCl反复溶解和析出DNA。方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方法：加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）。方案三原理：蛋白质和DNA的变性温度不同。方法：将滤液放在60—75℃的恒温水浴箱中。（三个方案）高中生物3、去除滤液中的杂质方案一原理：DNA在不同浓度Na6高中生物4、DNA析出与鉴定试管2支，编号甲乙→各加5mL2mol/L的NaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化滤液与等体积的冷却酒精（体积分数95%）混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。析出：鉴定：高中生物4、DNA析出与鉴定试管2支，编号甲乙→各加5mL27多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2高中生物多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2高中生物8一、基础知识高中生物1、PCR原理：与细胞内DNA复制类似一、基础知识高中生物1、PCR原理：与细胞内DNA复制类似9高中生物在PCR技术中：①扩增方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端

向3’端延伸。②解旋：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。③酶:耐高温的Taq—DNA聚合酶，高温不会失活。④条件：一定的缓冲溶液下才能进行，需提供DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时要控制温度。高中生物在PCR技术中：①扩增方向：DNA的合成方向总是从子10高中生物2、PCR的反应过程：每个循环包括：变性——复性——延伸要经历三十多次循环①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。高中生物2、PCR的反应过程：每个循环包括：变性——复性—11③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。高中生物

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用高中生12准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10s将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应二、实验步骤：高中生物准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量盖严盖子13高中生物三、结果分析与评价1、反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2、分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。3、测定：将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。4、计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰高中生物三、结果分析与评价1、反应液稀释：DNA在260nm14血红蛋白的提取和分离课题3高中生物血红蛋白的提取和分离课题3高中生物15一、基础知识：高中生物（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。2、概念：一、基础知识：高中生物（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：16高中生物当不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。3、原理：4、具体过程：高中生物当不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分子3、原理：4、17高中生物高中生物18（二）缓冲溶液：高中生物抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。1、原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等）。2、配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。3、作用：（二）缓冲溶液：高中生物抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而19高中生物

在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）高中生物在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液201、原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。(三)电泳：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。高中生物2、分离方法：3、分离过程：1、原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，琼脂21二、实验操作－－实验步骤样品处理粗分离纯化纯度鉴定血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白高中生物二、实验操作－－实验步骤样品处理粗分离纯22血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链

亚铁血红素血液组成成分阅读思考：血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链223血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白两个a－肽链两个β一肽链高中生物血液组成成分:血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐血细胞白细胞血小板红细胞血241、样品处理高中生物（1）红细胞的洗涤除去血浆蛋白等杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色1、样品处理高中生物（1）红细胞的洗涤除去血浆蛋白等杂蛋白25高中生物（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂(3)分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯高中生物（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破26高中生物(4)透析：在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。pH＝7的磷酸缓冲液维持血红蛋白的正常特性。缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分子充分地向外扩散。高中生物(4)透析：在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分27高中生物高中生物282、粗分离高中生物3、纯化（1）凝胶色谱柱的制作：（2）凝胶色谱柱的装填：教材图5－19（3)样品的加入和洗脱----透析除去分子较小的杂质----凝胶色谱操作2、粗分离高中生物3、纯化（1）凝胶色谱柱的制作：（2）凝胶29材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:（2）凝胶色谱柱的装填：步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱高中生物材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液（230(3)样品的加入和洗脱基本过程：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质高中生物(3)样品的加入和洗脱基本过程：高中生物31注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动高中生物注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使324、纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶