漆酶高产菌株的筛选实验方案

漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase,P-diphenoloxidase,EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。漆酶为含铜的糖蛋白，约由500个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。糖配基占整个分子的10%〜45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现，漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子，且这4个铜离子处于漆酶的活性部位，在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子，漆酶将失去催化作用。漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。实验一高产漆酶菌株酶活测定1主要试剂的配制（1） 0.2mmol/LpH4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液A液：0.2mmol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014甘，加入蒸馏水溶解定容至500mL。B液：0.2mmol/L柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412甘，加入蒸馏水溶解定容至500mL。A液和B液混合，搅匀，于pH计上调节至pH4.5。（2） 0.5mmol/L的ABTS溶液将一片ABTS片剂（142mg/片）用0.2mmol/LpH4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250mL,配成1.0308mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2mmol/LpH4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL。2实验方法漆酶活性的测定方法：从三角瓶中取出适量酶液，离心取上清得到粗酶液，放于样品管中。空白管加入1ml液体的PDA培养基。每支离心管中加入5倍的柠檬酸一柠檬酸钠溶液稀释。将样品管，空白管，0.5mmol/LABTS放在恒温水浴锅中，30°C预热10min。加入2mL预热好的酶液和0.5mmol/LABTS溶液达到3mL的反应液，于1cm比色皿中，启动反应5分钟，测定420nm下吸光值随时间的变化值，每分钟读一次数。在上述条件下，取吸光值变化的线性部分，定义每分钟转化1umol的底物所需的酶量为一个酶活力单位，用U/mL表示。运用以下公式计算酶活。漆酶酶活力U/mL= A°D"1 x酶液稀释倍数AtxV2xex10-6式中：e----ABTS在420nm下吸光系数，为3.6x104M-1•cm-1；At——1min；AOD----1min内，吸光度OD的变化值；V1----酶反应中，反应液的总体积，3mL；V2----酶反应中，酶液的体积，2mL。实验二高产漆酶菌株的酶学特性1主要试剂的配制（1） 0.2mmol/LpH2.0—8.0的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液A液和B液混合，搅匀，于pH计上分别调节至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。（2） 0.1—0.5mmol/L的ABTS溶液将一片ABTS片剂（142mg/片）用0.2mmol/LpH4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250mL，配成1.0308mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2mmol/LpH4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液分别配制100mL的0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的ABTS。2方法2.1米氏常数（Km值）的测定在pH3.5的条件下，配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L不同ABTS底物浓度，30°。反应，测定漆酶反应的初速度，求出二者的倒数，以1/V对1/[S]作图，按照双倒数法（Lineweave—Burk法）作图，得到斜率为Km/V的直线，由此得到米氏常数Km值。2.2漆酶的最适反应pH和pH稳定性测定将漆酶分别加入到pH2.0—pH8.0缓冲液中，在30°C下，测定漆酶活性，检测漆酶的最适反应pH。另外，将漆酶分别加入pH2.0—pH8.0缓冲液中，放置1h后，在30C，最适反应pH条件下，测定漆酶活性，以开始时漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的pH稳定性。2.3漆酶的最适反应温度和热稳定性测定在漆酶最适反应pH条件下，分别在不同温度（20C—80C）下，测定漆酶活性，得出漆酶的最适反应温度。将漆酶在pH3.5环境中，分别在不同温度（20°C—80°C）下保温1h，在最适反应温度、最适反应pH条件下测定漆酶活性，以保温前漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的热稳定性。2.4表面活性剂对漆酶活性的影响将漆酶置于含有1mmol/L表面活性剂（Tris、EDTA、Tween80），pH8.0缓冲液中，测定漆酶活性，以不添加表面活性剂漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，测定表面活性剂对漆酶活性的影响。实验三漆酶的固定化一、 实验原理壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D一葡胺糖的-NH2可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合，从而壳聚糖一戊二醛一酶结构，即固定化酶。本实验采用以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化漆酶。二、 材料、试剂和仪器材料：壳聚糖，漆酶试剂：1%的冰醋酸溶液、甲醛（37%）、1mol/LNaOH、0.8%的戊二醛（用磷酸缓冲液配制）、0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）、2mol/LNaOH1%冰醋酸溶液； 2mol/L的NaOH溶液37%的甲醛溶液； 0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲液；0.8%的戊二醛溶液； 0.1mol/LpH7.5的PBS磷酸缓冲液（内含0.5mol/L的NaCL）0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.2）：NaHPO-12HO,25.79g；NaHPO.-12HO,七 七4.37g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。0.1mol/L的PBS磷酸缓冲液（pH7.5）：Na2HPO4*12H2O，30.08g；NaH2PO4•12H2O，4.37g，NaCL，29.22g用蒸馏水溶解并定容至1000ml。0.8%的戊二醛溶液：将25%的戊二醛用磷酸缓冲液配制而成，现配现用。三、 实验步骤壳聚糖凝胶颗粒的制备称取0.5g壳聚糖充分溶解于35mL1%的冰醋酸溶液中，加入3mL甲醛(37%)迅速混匀，在40^水浴中静置保温60min，得到透明的凝胶，加少量蒸馏水将凝胶挤压破碎，倒出并在研钵中进一步破碎成适当大小的凝胶颗粒，接着在烧杯中使其悬浮于100mL蒸馏水中，不断地用2mol/L的NaOH将悬浮液的pH值调至8.0，放置10min，然后用蒸馏水在抽滤漏斗上洗涤凝胶颗粒数次，抽去多余水分，备用。壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒10g，加入40mL0.8%的戊二醛，室温放置60min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤凝胶颗粒3-4次，以除去多余的戊二醛，抽滤备用。酶的固定化向上述的凝胶颗粒中加入15mL漆酶酶液，4°C下放置1h，中间搅动数次，而后用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤凝胶颗粒3-4次，以除去未固定的酶，即得固定化酶。酶活力的测定溶液酶活力的测定残留酶活力的测定固定化酶活力的测定四、数据处理及计算固定化酶总活力数活力回收(%)= X100%溶液酶总活力数固定化酶总活力数相对活力(%)= X100%溶液酶总活力数一残留酶活力数实验四漆酶及固定化漆酶的应用一、 漆酶对染料及果汁内酚类物质的降解漠甲酚绿二、 染料最大吸收波长的确定将漠甲酚绿用pH4.5的柠檬酸缓冲液溶解，于UV-2450紫外可见分光光度计在200nm-800nm范围内