纳米金在电化学生物传感器中的应用

纳米金在电化学生物传感器中的应用

纳米技术是在纳米空间（0.1nm）上研究电子、原子、分子或原子团和分子的综合技术。它已深入每个领域，成为世界研究的热点。纳米材料是指基本单元的颗粒或晶粒尺寸至少在一维以上小于100nm的材料。它具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。这四种效应是纳米粒子、纳米固体材料的基本特性,也是纳米材料的性能与常规材料有很大差异的原因,而且这些效应使得纳米材料呈现优良的光学、电学性质和良好的生物亲合性。纳米材料所具有的表面效应和体积效应,使其与其它原子结合时表现出很高的化学活性,很容易与外界原子结合,而使纳米粒子的比表面积、表面能及表面结合能都迅速增大。另外,纳米粒子具有良好的生物相容性,能提供一个类似生物分子本体环境的微环境,可以很好地保持生物组分的活性,因此纳米粒子非常适合用于构制性能良好的电化学生物传感器。纳米微粒的高活性特异性、极微小性等特点与生物传感器所要求的多功能、微型化、高速化相对应,将纳米材料引入到电化学传感器中的研究中,取得许多创新性研究成果。本文综述了1995～2007年间,纳米金、碳纳米管和纳米线三种纳米材料在电化学生物传感器研究中的新进展。1纳米金纳米粒子作为生物传感器的应用纳米金是研究最早、在电化学生物传感器中应用最广泛的纳米颗粒之一。纳米金在电化学生物传感器中的应用包括以下几个方面:1.1纳米金作为电活性标记物金纳米颗粒除具有表面效应外,还具有良好的导电性能,因而比非金属纳米颗粒的增强作用更为显著,通常用于标记生物分子的纳米颗粒主要是纳米金。其所以如此,主要由于金纳米颗粒能与巯基之间发生强的共价键合,从而使胶体金与巯基标记的生物活性分子可结合形成探针,易用于生物体系的检测。关于胶体金在各种生物传感器中的信号放大作用的文献报道很多。其中,一种非常成功的方法是将纳米技术、核酸杂交技术和电化学分析技术三项技术在电极表面相结合,实现对DNA的高灵敏检测。例如,Wang和Authier都报道了将纳米金颗粒接在寡核苷酸的末端作为电活性标记物,杂交完成后,在强酸的作用下使金纳米粒子溶解释放出大量的Au(Ⅲ)离子,用阳极溶出伏安法或电位溶出法测定Au(Ⅲ)的响应信号从而间接测定DNA的含量。Ozsoz等以纳米金作为电活性标记物,先在纳米金表面修饰半胱胺,然后用EDC和NHS活化偶联Factor-V寡聚核苷酸片段以制备电活性DNA探针,与固定在笔式电极上的互补DNA杂交,制备了重现性和稳定性良好的电化学DNA传感器,检出限达0.78fmol。Cai等将纳米金标记在巯基修饰寡核苷酸末端,然后将金标记的DNA捕获到电极表面,并结合免疫分析中的“金标银染”技术完成对特定序列的DNA互补链的识别以及对DNA链中的碱基突变的电化学检测。Wang等将抗生蛋白链霉素固定于磁性纳米粒子上用来固定生物素修饰的DNA探针,利用电化学方法检测纳米金标记的DNA。胡劲波等用带有二茂铁的纳米金微粒/抗生蛋白链菌素结合物为标记物,将其标记于生物素修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性和纳米金放大作用的DNA电化学生物传感器。通过伏安法测定了修饰在纳米金上的二茂铁的氧化还原电流,从而识别和测定溶液中互补的靶点DNA,检出限达7.5×10-13mol/L。Fang等合成了一种新的Cu/Au核壳型纳米粒子,并将其应用于大肠杆菌毒素基因分析。他们用低温法制备了一种以Cu为核,Au薄层为壳的核壳型纳米粒子,使之易于和ssDNA进行功能性聚合,这种核壳型Cu/Au纳米粒子与有5’-巯基修饰的ssDNA偶联,制备成纳米标记的DNA探针,待测ssDNA固定在玻碳电极表面,当它与相对应的Cu/Au核壳纳米粒子标记DNA探针杂交后形成含有纳米标记物的DNA杂交分子,用酸将标记物中的纳米粒子溶解后使用高灵敏的阳极溶出伏安法进行测定,对大肠肝菌毒素DNA的检出限为5.0pmol/L。Fang的研究小组还结合核酸适体技术和纳米技术,构建以凝血酶蛋白为研究对象的高效、高灵敏、特异性识别蛋白质的适体电化学生物传感器。他们利用金纳米颗粒标记的核酸适体以及被固定在磁性纳米颗粒上的核酸适体与凝血酶蛋白同时结合形成磁性颗粒/凝血酶/纳米金胶的三明治结构,利用磁性分离,将金胶纳米颗粒特异性地吸着到电极表面,通过检测电极上金胶的电化学信号,实现对凝血酶靶蛋白的检测。检测凝血酶蛋白质的线性范围为5.6×10-12mol/L～1.12×10-9mol/L,检出限为1.4×10-12mol/L。这些研究都属于DNA分析的前沿课题。1.2纳米金用于构制电化学生物传感器的活性界面在生物传感器的制作中,生物活性分子的固定化技术直接关系到生物传感器的重现性、灵敏度、寿命等性能。利用纳米粒子作为固定生物分子的载体以构制生物传感器的活性界面,可以制备性能良好的生物传感器,这一方面是由于纳米粒子具有良好的生物相容性,能提供一个类似生物分子本体环境的微环境,可以有效保持生物材料的活性;另一方面,表面效应是纳米颗粒最重要的效应之一,纳米颗粒的表面效应使其具有很高的表面吸附能力,是固定生物材料合适的媒介,同时纳米粒子可与生物分子的某些特定基团定向结合,使固定的生物分子达到定向排列、取向规则的目的,从而能够进一步提高生物分子的活性,近年来有不少报道利用纳米材料作为固定生物材料的媒介以构制生物传感器的活性界面,为电化学生物传感器的发展开辟了新途径。例如,RetnaRaj等将半胱胺自组装于金电极上,再利用半胱胺的末端氨基自组装纳米金,该修饰电极对多巴胺的电化学氧化有显著的催化作用,检出限为0.13umol/L,并能有效地排除抗坏血酸的干扰。Xiao等将HRP自组装到纳米金/半胱胺修饰的金电极上构制了第三代的HRP生物传感器。Liu等将葡萄糖氧化酶固定在纳米金修饰的碳糊电极表面构制了不需要电子媒介的葡萄糖传感器,还将纳米金分散掺杂到包埋酪氨酸酶的碳糊电极中,制备了无需电子介体的性能良好的酚类传感器,并对纳米金明显提高传感器性能的原因进行分析,认为:纳米金在体系中起着提高酶的生物活性,使酶更容易接近底物分子的作用。Ju等通过将HRP固定在纳米金修饰的碳糊电极表面构制了电极表面可更新的HRP生物传感器。唐芳琼等通过使用纳米憎水Au、亲水Au、憎水SiO2颗粒与聚乙烯醇缩丁醛混合构成复合固酶膜基质,用溶胶-凝胶法固定葡萄糖氧化酶,从而构制了纳米颗粒增强的葡萄糖生物传感器,实验表明,纳米金可以大幅度地提高固定化酶的催化活性,增大响应电流。Chen等在Au电极表面修饰一层半胱胺,它可以共价结合戊二醛,通过戊二醛,再结合一层半胱胺,半胱胺的巯基用于固定纳米Au,形成纳米Au活性界面,用此活性界面固定HRP,制成H2O2传感器,研究结果表明:固定在纳米金Au上的HRP活性得到有效保持,对H2O2有很强的催化能力。以上研究说明,以纳米材料为载体固定酶时具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强等特点,使其逐渐成为固定化载体中最热门的研究对象之一。纳米金也被用于免疫传感器的制作中,王存嫦等利用等离子体聚合膜沉积技术和纳米金自组装技术设计传感器界面,在石英晶振表面上沉积正丁胺等离子体聚合膜,然后用戊二醛交联结合半胱胺,在半胱胺膜上组装纳米金单层膜,得到可用于固定IgM抗体的压电免疫传感器。结果表明,以纳米金单层作界面固定抗体时,具有传感界面不需活化、固定抗体的活性高、检测时的非特异性吸附小、传感器能反复再生等优点。Ou等通过层层自组装技术构建了基于纳米金/碳纳米管/硫堇自组装多层膜的新型电流型癌胚抗原免疫传感器。他们借助硫堇膜上富含的氨基基团实现对碳纳米管与纳米金颗粒二元纳米复合材料的化学组装,制备稳定的纳米金/碳纳米管/硫堇/壳聚糖传感界面,以此传感界面固定免疫活性物质,从而制得高灵敏、高稳定的电流型癌胚抗原(CEA)免疫传感器。通过循环伏安法考察了电极表面的电化学特性,并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究,该传感器对CEA检测的线性范围为0.5ng/mL～15.0ng/mL和15.0ng/mL～200.0ng/mL,检出限为0.01ng/mL。1.3纳米金用于研究蛋白质的直接电子转移众所周知,氧化还原蛋白质/酶很难实现在裸露的金属电极上直接发生电子转移反应。因而,近年来电化学工作者非常关注氧化还原蛋白质/酶的直接电化学研究,而构筑无需电子介体的电化学生物传感器成为研究的热点。Naton等首先报道了细胞色素C在纳米金溶胶修饰二氧化锡电极表面上的直接电子传递。他们将金胶自组装在SnO2电极上,并用金胶吸附细胞色素C,然后进行循环伏安扫描,出现了对称的氧化还原峰,通过实验证实为细胞色素C在电极表面的直接电子传递。Jia等在金电极表面修饰含巯基的溶胶-凝胶膜,再将纳米金自组装到巯基上,最后将HRP固定到纳米金表面,由此固定的HRP可直接电化学检测H2O2,构建无需电子媒介的第三代H2O2生物传感器。研究表明,固定在纳米金上的HRP的活性得到有效的保护,纳米金与HRP作用,缩短了酶活性中心与电极表面的距离,从而实现了其直接电子传递,并且纳米金的导电通道也有助于蛋白质与电极表面之间的直接电子转移。这方面的工作还有Bharathi和陈洪渊的研究小组都报道了采用胶体金实现血红蛋白在电极表面的直接电化学。2碳纳米管传感器碳纳米管是一种特殊结构的一维量子材料,它的径向尺寸为纳米级,轴向尺寸为微米级,主要由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管,相邻的同轴圆柱面之间的间距与石墨层间距相当,约为0.34nm。根据管臂中碳原子的层数可分为单臂碳纳米管(SWNT)和多臂碳纳米管(MWNT)。碳纳米管的管壁中存在有大量的拓朴学缺陷,比其它的石墨变体有更大的反应活性;由于碳纳米管壁的弯曲,使电荷在其中的传输比石墨更快,在化学反应中用作电极时,呈现出更大的电荷传递速率。碳纳米管兼具有金属性和半导体性,导电性很强,并且具有大的比表面积和优良的电催化性能,是优越的电子传递媒介,能促进电活性物质的电子传递过程。另外,碳纳米管具有较好的柔韧性,很强的抗压能力,因此碳纳米管作为电极材料和电活性材料在构筑电化学生物传感器方面具备了独特的优势。Azamian等将葡萄糖氧化酶固定在SWNT表面,仍能很好地保持酶的活性,经过比较研究发现,酶的催化活性比普通碳电极固定的酶的催化活性提高1个数量级,这是由于碳纳米管特殊的中空管状结构使之具有较大的比表面积,因而将碳纳米管用于酶分子的固定可以增加固定的酶分子数从而增强反应信号,同时碳纳米管对酶活性中心的电子传递具有促进作用,能够提高酶分子的相对活性。Wang等用多臂碳纳米管固定葡萄糖氧化酶来测定葡萄糖,传感器的响应时间短,灵敏度和稳定性也得到了提高。近年来,碳纳米管也被用于多巴胺和NADH等生物传感器的构置。根据碳纳米管本身的催化和增敏效应,使得基于碳纳米管的电化学生物传感器具有广阔的应用前景。在传感器的制作技术上,改变了以前无序地把碳纳米管固定在电极表面的做法,构置阵列型有序的碳纳米管传感器渐渐地成为了研究的重点。Lin等在电极表面定向生长SWNT超微电极阵列,由于电极与电极之间的距离大于扩散层的半径,所得电极具有超微电极的性质。SWNT管端的羧基用EDC和NHS活化,通过形成酰胺键偶联结合GOD,传感器的响应时间为20s～30s,检出限为8×10-5mol/L。Ye等合成了有序排列的多臂碳纳米管束(well-alignedMWNTs)修饰电极,利用碳纳米管的电催化效应不加任何酶直接对葡萄糖进行测定,与一般玻碳电极相比产生了400mV的电位降。J.I.Yeh等将碳纳米管阵列电极的末端羧基用EDC和NHS活化,用于组装NADH氧化酶和功能化的金纳米颗粒,制成了高灵敏检测NADH的传感器。由于快速、简单、低成本检测基因和传染性疾病研究的需要,基于核酸识别过程的电化学DNA生物传感器近年来得到迅速地发展,而碳纳米管在DNA电化学传感器中也有广泛应用,Wang等成功地将CdS标记在碳纳米管增强的DNA探针上,研制成了检出限达到pg级的DNA传感器。Wang等还报道了一种利用碳纳米管超灵敏检测目标DNA和抗原的分析方法,其方法原理是基于酶标记物来放大检测DNA或抗原蛋白的信号。碳纳米管在体系中具有双重作用:一是大量的固定酶标记物起年个到的放大作用;二是利用碳纳米管换能器的富集特性放大酶促反应产物的电化学信号。Rivas利用多壁碳纳米管糊电极(CNTPE)研究了鸟嘌呤碱基对在电极上的吸附固定和电化学氧化。结果表明:与玻碳电极、碳糊电极和石墨电极相比,CNTPE电极能极大地提高鸟嘌呤的氧化信号,并且利用此结果制备了无标记DNA杂交传感器,并用于通过短时间富集检测痕量(μg/L)核酸。Johnston等利用碳纳米管制备的DNA生物传感器可以达到6amol的检测限。Gang等通过分析CNT与DNA的相互作用获得了DNA的序列信息。碳纳米管由于具有良好的内在导电性,又能保持蛋白质和酶的生物活性,因而在蛋白质直接电子转移的研究中具有广泛的应用价值。Davis等以碳纳米管糊作为电极材料研究了细胞色素C和铜绿假单胞菌的电子转移响应。Yan等研究了血红素蛋白质如HRP、Hb、Mb、Cytc在碳纳米管上的电化学及电催化行为,为构建第三代H2O2生物传感器奠定了基础。Zhao等将HRP吸附在CNT上,制作成CNT微电极,在此基础上构置MWNT修饰的第三代HRP生物传感器,并研究了HRP在电极上的直接电化学。李南强等研究了细胞色素C在SWNT修饰电极上的直接电化学,在浓度范围3.0×10-5～7.0×10-4mol/L内,峰电流和细胞色素C的浓度成正比,检出限为1.0×10-5mol/L。Chen等研究了细胞色素C在DNA/MWNT修饰电极上的直接电化学。Cai等和Zhao等分别报道了血红蛋白和肌红蛋白在碳纳米管修饰电极表面的直接电子转移现象。电子的直接转移使得这两种蛋白构成的修饰电极对H2O2和NO产生明显的催化作用。这些现象的产生原因一方面是由于碳纳米管的表面缺陷导致了较高的表面活性,有利于酶和碳管之间的电子传递,另一方面是由于碳纳米管起到分子导线的作用,将电子传递到酶的氧化还原活性中心所致。JustinGooding等把微过氧化物酶microperoxidaseMP-11固定在有序排列的SWNT末端,以SWNT作为分子导线加速电子传递过程,实现了该氧化还原蛋白质在金电极上的直接电子转移。这些研究都体现了碳纳米管对生物分子的电催化作用,显示了其作为生物传感器的应用潜能。3基于纳米线的电化学测量准一维实心的纳米材料是指在两维方向上为纳米尺度,长度比上述两维方向上的尺寸大得多的新型纳米材料。其中纵、横比小的称作纳米棒,纵、横比大的称作纳米线。一般情况下,长度大于1μm的称为纳米丝或纳米线。作为纳米材料的成员之一,纳米线因其优越的光学性能、电学性能以及力学性能等特性而引起物理界、化学界及材料界科学家们的普遍关注,近年来成为纳米技术研究的热点。纳米线远不如前述的纳米金粒子和碳纳米管在电化学领域的应用广泛。这主要的原因是制备过程中模板的选择比较困难。尽管如此,电分析工作者仍