叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告

生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质提取与分离实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。实验步骤色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。同时可见其他色素带。表明叶绿体中色素不限于以上4种。理化性质实验目的验证叶绿素的理化性质。实验原理叶绿素是一种有叶绿酸与甲醇形成的复合酯，故可发生皂化反应。叶绿素化学性质不稳定，见光分解。叶绿素中的Mg可以被H+取代而形成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则变成铜带叶绿色。实验材料与试剂新鲜菠菜叶片，叶绿素提取液；刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管；95%乙醇，苯，醋酸铜粉末，5%稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钠—甲醇溶液。实验步骤光对叶绿素的破坏取两支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素提取液，一支放在阳光下，另一支用锡纸包好，40分钟后观察；取实验一中薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用锡纸包好，放在阳光直射下半小时，观察。皂化作用取一支10ml刻度试管加入3ml叶绿体色素提取液，加入1ml氢氧化钾—甲醇溶液，充分摇匀；加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml蒸馏水，轻轻摇匀，静置。H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用取两支试管，分别加入5,ml叶绿素提取液，第二支中加入盐酸，待溶液变褐色后，加入少量醋酸铜粉末，60°C水浴加热。取两片新鲜叶子，放入试管中，加入醋酸—醋酸铜溶液，90°C水浴。荧光现象取一只小试管加入5ml叶绿素提取液，在直射光和反射光照射下观察。实验结果与分析（1）光对叶绿素的破换图中两只试管，左边为对照组，右边为实验组，在阳光照射下40分钟。可以看出，右侧试管中提取液颜色较浅，是由于色素见光分解特别叶绿素受光影响更大。右侧色素颜色稍浅。这个实验并不成功，主要原因是天气，阴天阳光照射不够强。(2)皂化作用分层现象明显，上层黄色，下层绿色，第三层为乳白色。苯层中溶有叶黄素、胡萝卜素，乙醇层中为皂化的叶绿素，下层为实验操作失误造成的乳化现象。（3）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用左图：左侧为对照组，右侧为褐色，是因为生成了去镁叶绿素。右图：左侧为对照组，右侧绿色加深，是由于变成铜代叶绿素，但由于醋酸铜量过多，有沉淀。叶片几分钟后变黄，是因为生成了去镁叶绿素，最终变成深绿色，是由于变成铜代叶绿素。左图为反射光，呈红色，右图为直射光，成绿色。其主要原理是由于叶绿素有两个不同的吸收峰。叶绿素吸收光的能力极强，如果把叶绿素的丙酮提取液放在光源与分光镜之间，可以看到光谱中有些波长的光被吸收了。因此，在光谱上就出现了黑线或暗带，这种光谱叫吸收光谱。叶绿素吸收光谱的最强区域有两个：一个是在波长为640nm～660