应用双向电泳技术分析的杜鹃叶片蛋白提取方法

应用双向电泳技术分析的杜鹃叶片蛋白提取方法

杜鹃花是一种美丽的花，花期多变，花期长，观赏价值很高。中国丰富的野生杜鹃资源。但这些野生品种大多分布在高海拔地区,对生态环境要求较严,性喜冷凉湿润气候,对高温的忍耐力不强。高温胁迫是制约其引种驯化和园林利用的主要限制因子。研究杜鹃花属植物对高温的适应性及其耐热机理,对于杜鹃花属植物的引种和园林应用有着重要的意义。植物受到高温胁迫会通过产生一系列热激蛋白来适应这种逆境,利用蛋白质双向电泳技术可以寻找与杜鹃耐热性相关的热激蛋白,将有利于杜鹃花属植物耐热性机理的研究。蛋白质提取是双向电泳的第一步,提取效果的好坏直接影响蛋白质的分离及最后结果的可靠性。提高样品蛋白质的溶解性并降低蛋白质的损耗和降解,才能获得更多的蛋白质信息。由于植物叶片本身蛋白含量低,且常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物,这些成分都会干扰叶片蛋白质的提取分离及电泳,而且不同植物材料中的干扰物质也不尽相同。故针对不同的植物常需重新建立有效的蛋白质提取方法和标准化双向电泳技术体系。Gary等采用酚法成功地进行了山柳叶杜鹃(R.catawbiense)叶片蛋白的提取和双向电泳分析,本研究预备实验中,参照Gary等的方法进行映山红叶片蛋白的提取,但未成功。目前常用的蛋白提取方法主要有TCA-丙酮沉淀法、饱和酚提取法、Tris-HCl法、TCA-丙酮-酚法等,这些制样方法各有利弊。本实验在前期预备实验中参照曾广娟等的Tris-HCl法对4种杜鹃叶片蛋白进行提取,由于映山红、满山红、马银花3种杜鹃在加入蛋白提取缓冲液后均很粘稠,未能成功提取蛋白,故最终选取了TCA-丙酮法、酚法和TCA-丙酮-酚法3种方法对映山红、马银花、满山红、云锦杜鹃4种杜鹃花属植物的蛋白提取方法及双向电泳结果进行了系统的比较,以建立适合杜鹃花属植物的双向电泳蛋白提取方法。1材料和方法1.1材料和试验材料以常绿杜鹃亚属的云锦杜鹃(R.fortunei)、马银花亚属的马银花(R.ovatum)、映山红亚属的映山红(R.simsii)和满山红(R.mariesii)4种杜鹃3年生实生苗为试验材料。于2013年7月采集4种杜鹃的功能叶,洗净擦干,液氮速冻,置于-80℃冰箱保存备用。1.2方法1.2.1蛋白及其产物的提取TCA-丙酮法:参照鲁丹等的方法,取冻存的样品0.5g,加入0.05gPVPP,液氮研磨至细粉后转入10mL离心管,加10倍体积-20℃预冷的丙酮溶液(含10%TCA和0.1%DTT),-20℃静置30min,接着冰水超声5min,-20℃静置1h后离心(4℃,10000×g,20min),弃上清液,加10倍体积预冷的丙酮溶液(含0.1%DTT),-20℃静置1h,离心,重复4~5次,至上清无色为止。沉淀经真空干燥后得蛋白干粉,称重后置于-80℃冰箱保存。酚法:参照Gary等的方法,取冻存的样品1g,加入0.1gPVPP,液氮研磨成粉状后,向研钵中加入4mLTris提取液(0.7mol·L-1蔗糖,0.5mol·L-1Tris,50mmol·L-1EDTA,100mmol·L-1KCl,50mmol·L-1DTT,1mmol·L-1PMSF;调pH至8.0),融化后,继续研磨数分钟,转至离心管,加入等体积pH8.0Tris-饱和酚,涡漩,离心(10000×g,4℃)20min。取酚层,往酚层中加入5倍体积0.1mol·L-1乙酸铵甲醇溶液,-20℃沉淀过夜。离心(10000×g,4℃)20min,弃上清液,沉淀用-20℃预冷甲醇洗涤1次,再以丙酮(含0.1%DTT,-20℃预冷)洗涤2次,室温干燥,所得干粉置-80℃保存待用。TCA-丙酮-酚法:参照Wang和杨妮娜的方法。取1g叶片,用TCA-丙酮法提取的干粉,再加入酚法提取缓冲液。接着按照酚法的程序提取蛋白。1.2.3民法典g胶条的制作采用Bio-Rad公司的ProteinIEFcell等电聚焦系统和ProteinIIxicell垂直电泳系统。选用17cm的pH4-7IPG胶条,具体操作步骤参照鲁丹的方法。电泳结束后考马斯亮蓝R-250染色。2结果与分析2.1酚法提取叶片蛋白由表1可以看出TCA-丙酮法提得蛋白干粉最多,但是加了蛋白裂解液之后特别粘稠,且蛋白质浓度很低。酚法能提出云锦杜鹃、满山红和马银花3种杜鹃的叶片蛋白,但没有提取到映山红叶片蛋白。4种杜鹃采用TCA-丙酮-酚法均成功得到蛋白质,且提得蛋白质的产量与4种杜鹃叶片研磨后的粘稠度呈负相关,云锦杜鹃、满山红、马银花3种杜鹃叶片蛋白浓度略低于酚法。2.2酚法和酚法提取蛋白4种杜鹃用TCA-丙酮法提取的叶片蛋白浓度均较低且粘稠,等电聚焦电泳升的极其缓慢,双向电泳图谱蛋白质点也比较少,如图1-A所示,满山红的双向电泳图谱蛋白质点仅19个,远远达不到2-DE分析的要求。其他3种杜鹃的蛋白质提取和双向电泳结果也存在类似情况。说明杜鹃叶片中的粘稠物质严重干扰了蛋白质的有效溶解及离心,导致上样液中蛋白浓度不足,而不能通过双向电泳显示出来。因此,该法完全不适合用于满山红等富含粘稠物质的杜鹃叶片蛋白质的提取。酚是一种温和的变性剂,蛋白质容易进入酚层,这样可有效去除样品中的杂质。满山红、云锦杜鹃和马银花均通过酚法成功提取得到了蛋白,而映山红在叶片研磨加入蛋白提取液之后非常粘稠,加入酚用醋酸铵甲醇溶液沉淀后未得到蛋白沉淀。满山红、云锦杜鹃、马银花的2-DE图谱(图1-B、E、G)分析得出,满山红得到97个点,马银花得到159个点,云锦杜鹃得到241个点(表1)。但除了马银花,两外2种杜鹃叶片的2-DE图谱中均有大量的横纵条纹。可以看出酚法萃取蛋白能够除去这3种杜鹃中的粘稠物质,但对于映山红这种粘稠物质特多的植物而言并不适合。为改良上述2种方法中的缺陷,故将TCA-丙酮法和酚法结合在一起,先用TCA-丙酮法沉淀蛋白,再接着用酚法萃取,4种杜鹃均成功得到蛋白沉淀。4种杜鹃的双向电泳图谱分析得出云锦杜鹃有396个点,显著高于云锦杜鹃酚法的提取结果;马银花得到223个点,满山红得到173个点,映山红得240个点(表1,图1-C、D、F、H),均高于酚法提取得到的蛋白点。且蛋白点外观圆润清晰,明显减少了横纵条纹,说明干扰物质明显减少。故TCA-丙酮-酚法适合上述4种杜鹃蛋白质的提取及双向电泳。3样品溶液粘结原因TCA-丙酮法是植物蛋白提取最常用的方法,操作步骤简单,蛋白粗提物产量大,但TCA-丙酮法提取的蛋白质不易溶解且粘稠,电泳结果中蛋白质数量相对较少,且容易产生横纹和纵纹干扰。本实验中4种杜鹃用该法提得的蛋白溶解度均非常低且粘稠,并且等电聚焦消耗时间长,这可能是上样液中杂质过多且盐离子浓度高。过高浓度的盐离子增加了胶条的导电性,导致电泳的内渗升高,从而导致等电聚焦时电压不能达到预设值,进而干扰蛋白质的等电聚焦,在双向电泳图谱中造成水平方向的纹理。彭存智等认为导致蛋白质样品溶液粘稠的原因是蛋白质样品中含有大量的多糖类物质,因为在使用丙酮等有机溶剂沉淀蛋白的同时,多糖类物质也沉淀下来了。多糖类物质可溶于水,从而导致蛋白质样品溶液粘稠并影响蛋白质的溶解,进而影响了蛋白质样品的上样量和电泳的质量。利用多糖类物质不溶于酚相这一特征,可使用饱和酚萃取蛋白,从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质,但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。在本实验中,云锦杜鹃、马银花、满山红使用酚法成功萃取出蛋白,但得到的蛋白质点均低于TCA-丙酮-酚法,2-DE图谱横纵条纹过多。且酚法并不适用于映山红这种叶片研磨后高度粘稠的植物,可能是由于过于粘稠,导致蛋白无法进入酚相,从而不能成功萃取蛋白。TCA-丙酮-酚法融合了TCA-丙酮沉淀法和酚法优点,能够有效去除干扰物质,在很多植物如竹子、橘子、甘蔗、烟草、松树、海草、橄榄、苹果、葡萄等的蛋白提取上都取得了非常好的效果,且2-DE的图谱背景清晰,蛋白质点多,可广泛应用于植物的叶片和果实中蛋白质的提取。4种杜鹃使用该法提取蛋白取得了良好的电泳结果,蛋白点清晰且蛋白质点要多于酚法,更重要的是对于映山红这种研磨液高度粘稠的植物也成功萃取出了蛋白。3种蛋白提取方法的双向电泳结果分析表明,TCA-丙酮-酚法更适合4种杜鹃的蛋白提取,这与Ana对拟南芥和杨妮娜对银杏的研究结果是一致的。本实验选取了4种杜鹃,其中映山红、满山红为纸质叶片且冬季落叶,马银花、云锦杜鹃为革质叶片且常绿;马银花、满山红叶片光滑,映山红、云锦杜鹃叶片有绒毛;马银花、映山红叶片有部分红色,云锦杜鹃、满山红为绿色,4种杜鹃代表性广,故可以认为TCA-丙酮-酚法适合于杜鹃属植物叶片蛋白质的提取。1.2.2上样液的制备将蛋白质加入裂解液(含7mol·L-1尿素,2mol·L-1硫脲,4%Chaps,1%DT