新高考生物人教版一轮复习课件第12单元第1讲基因工程

第1讲基因工程课标考情——知考向核心素养——提考能课标考点1.简述基因工程的诞生2．简述基因工程的原理及技术(含PCR技术)3．举例说明基因工程的应用4．简述蛋白质工程5．活动：DNA的粗提取与鉴定生命观念基因的结构决定其功能科学思维能够结合具体实例，归纳与概括转基因的原理和步骤，并构建流程图科学探究蛋白质工程的应用，DNA的粗提取与鉴定社会责任基因工程在生产实践中的应用，防止基因污染，保护环境课标考情——知考向核心素养——提考能近年考情2020全国卷Ⅲ(38)、2020山东卷(25)、2019全国卷Ⅰ(38)、2018全国卷Ⅰ(38)、2017全国卷Ⅰ(38)趋势分析1.考查方式：非选择题2．广东命题趋势：(1)对基因工程的考题每年均有出现，基因工程是本专题考查的重点；(2)对基因工程、细胞工程的综合运用进行考查是高考考查的新方向基因工程的别名基因拼接技术或__________技术操作环境__________操作对象基因操作水平__________水平自主学习·巩固基础知识点一基因工程及基因工程的基本工具1．基因工程的概念[自主学习]DNA重组

生物体外

DNA分子

基本过程剪切→______→______→表达结果人类需要的________或生物类型优点①可________生物的遗传性状；②可克服远缘杂交不亲和性拼接

导入

基因产物

定向改造

2．基因工程的基本操作工具【答案】原核生物磷酸二酯键黏性末端磷酸二酯键黏性末端平末端目的基因质粒自我复制1．思考判断(1)有关工具酶的判断①限制酶只能用于切割目的基因。 (

)②切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (

)③DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。 (

)④E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(

)⑤限制酶也可以识别和切割RNA。 (

)[自主检测](2)有关载体的判断①载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(

)②每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。 (

)③质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。 (

)④载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。 (

)⑤外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (

)【答案】(1)①×

②×

③×

④×

⑤×(2)①×

②√

③√

④√

⑤×2．深挖教材(1)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？(2)切取目的基因与切割载体时只能使用“同一种酶”吗？(3)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？【答案】(1)提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)提示：①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平)末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，在切割目的基因和载体时，均使用两种不同的限制酶，使目的基因和载体各具有两个不同的末端。(3)提示：不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。知识点二基因工程的基本操作程序及应用[自主学习]基因

基因文库

mRNA反转录

DNA合成仪

PCR技术

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、____________等。①启动子：a．位置：位于______________。b．作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因________________，最终获得所需要的蛋白质。②终止子：a．位置：位于基因的尾端。b．作用：使______在所需要的地方停止下来。标记基因

基因的首端

转录出mRNA

转录

(2)构建的目的。①使目的基因在______________中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使______________能够表达和发挥作用。受体细胞

目的基因

稳定和表达

农杆菌转化法

花粉管通道法

显微注射

方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无______水平分子杂交技术检测__________________________________技术检测目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性个体水平4．目的基因的检测与鉴定目的基因是否转录

分子

抗原—抗体杂交

5．基因工程的应用(1)植物基因工程：主要用于提高农作物的________，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。(2)动物基因工程：主要应用于动物品种改良、建立生物反应器、______________等方面。(3)基因工程药物：来源于转基因的________。(4)基因治疗：把__________导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。抗逆能力

器官移植

工程菌

正常基因

1．思考判断(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。

(

)(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(

)(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (

)(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。 (

)(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(

)【答案】(1)×

(2)√

(3)×

(4)√

(5)√[自主检测]2．深挖教材(1)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器知识，结合基因工程操作程序的基本思路，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？(2)启动子＝起始密码子吗？终止子＝终止密码子吗？(3)目的基因的插入位点是随意的吗？【答案】(1)提示：不可以。糖蛋白上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。(2)提示：①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(3)提示：不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。知识点三蛋白质工程1．概念理解(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。(2)操作：__________或基因合成。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出_____________。(4)目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对________________进行分子设计。[自主学习]基因修饰

新的蛋白质

蛋白质结构

2．蛋白质工程的设计流程【答案】功能蛋白质结构氨基酸序列脱氧核苷酸序列1．思考判断(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。 (

)(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。 (

)(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。 (

)[自主检测](4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 (

)(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 (

)【答案】(1)√

(2)×

(3)×

(4)√

(5)×2．深挖教材(1)科学家将药用蛋白基因与________________等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的________中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品，因而称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。(2)用于基因治疗的基因有三类。第一类是从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以__________，或依靠其表达产物，来弥补病变基因带来的生理缺陷，如对血友病和地中海贫血病的治疗。第二类是反义基因，即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的______进行互补，来阻断非正常________合成。第三类是编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫作____________。(3)蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？(4)基因芯片的原理、检测方法、应用分别是什么？【答案】(1)提示：乳腺蛋白基因的启动子受精卵(2)提示：取代病变基因mRNA蛋白质自杀基因(3)提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。(4)提示：原理：DNA分子中的碱基互补配对原则。检测方法：荧光标记法。应用：基因诊断、新药筛选、临床用药指导等方面。知识点四DNA的粗提取和鉴定1．实验原理(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。[自主学习]溶解

析出

比较项目溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液蛋白质NaCl溶液物质的量浓度从2mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐______部分发生盐析沉淀______增大

溶解

酒精溶液

蓝

2．操作流程【答案】DNA蒸馏水不同浓度的NaCl溶液酒精二苯胺蓝思考判断(1)DNA既溶于2mol/LNaCl溶液，也溶于蒸馏水。 (

)(2)根据高中生物学实验的基本原理，提取DNA是利用不同化合物在溶剂中溶解度的差异。 (

)(3)洗涤剂能溶解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度。(

)(4)将丝状物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。 (

)【答案】(1)√

(2)√

(3)×

(4)×[自主检测]重难探究·素养达标基因工程的操作工具[深度讲解](2)切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。①当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。②当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。2．限制酶与DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。3．与DNA分子相关的几种酶的比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两

条

链之

间

的氢

键

打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子4．选择限制酶的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。④如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。基因工程操作基本工具的8个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。

(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。[考向预测]考查基因工程的操作工具(素养目标：生命观念)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由____________________________连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是______末端，其产物长度为______________________。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是____________________________________________________________________________________________。【答案】(1)脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖(2)平537bp、790bp、661bp

(3)4

(4)BamHⅠ抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接【解析】(1)两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。(2)根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537bp、790bp、661bp。(3)图1中有SmaⅠ的两个识别序列，完全切割后产生3个不同长度的DNA片段，若虚线方框中的碱基对被T—A碱基对替换，再经SmaⅠ识别并完全切割后会产生2个DNA片段，其中1个DNA片段与未替换前完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。(4)切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。基因工程的操作过程及蛋白质工程及其与基因工程的关系[深度讲解]2．基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成及作用。(2)构建过程。3．将目的基因导入受体细胞4．目的基因的检测与鉴定5．蛋白质工程与基因工程的区别和联系基因工程中的3个易错点(1)基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。

[考向预测](一)考查基因工程的操作过程(素养目标：科学探究)1．转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如下图所示(①～④代表过程，A～C代表结构或细胞)：(1)在图中①基因表达载体的构建过程中，为了使目的基因正常表达，目的基因的首端必须有________________________识别和结合的部位。若选择的限制酶切出的DNA片段是平末端，应选择____________进行连接。(2)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是________________，之所以要把目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，这是利用T­DNA______________________________________的特点。(3)过程②的具体操作：先用____________处理农杆菌，使其处于感受态；再将含乙肝病毒表面抗原基因的重组Ti质粒溶于缓冲液中与经处理的农杆菌混合，完成转化过程。(4)图中③和④过程分别叫作__________________，将叶盘培养成草莓幼苗所依据的原理是__________________________。(5)乙肝病毒表面抗原的基因能否在草莓植株体内维持稳定遗传的关键是________________，通常采用__________________的方法进行检测。【答案】(1)RNA聚合酶T4DNA连接酶(2)农杆菌转化法可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上(3)Ca2＋

(4)脱分化和再分化植物细胞的全能性(5)目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上DNA分子杂交(二)考查蛋白质工程的应用(素养目标：社会责任)2．干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染和癌症，但体外保存相当困难，如果将其分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可以在－70℃条件下保存半年，给广大患者带来了福音。(1)蛋白质的合成是受基因控制的，因此获得能够控制合成“可以保存的干扰素”的基因是生产的关键，依据蛋白质工程原理，设计实验流程，让动物生产“可以保存的干扰素”：(2)基因工程和蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产________________的蛋白质，不一定符合________________的需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过___________或_____________，对现有蛋白质进行_______，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需要。(3)蛋白质工程实施的难度很大，原因是蛋白质具有十分复杂的________结构。(4)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？__________________________________。原因是_______________________________________________________。【答案】(1)预期的蛋白质功能预期的蛋白质结构应有的氨基酸序列相对应的脱氧核苷酸序列(基因)

(2)自然界已存在人类生产和生活基因修饰基因合成改造(3)空间(4)应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造首先，任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是改造了蛋白质，并且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传给下一代。如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传给下一代。其次，对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多DNA的粗提取和鉴定[深度讲解]1．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较试剂浓度用途主要原理NaCl溶液2mol/L溶解DNADNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2mol/L时最大，在0.14mol/L时最小0.14mol/L析出DNA2mol/L鉴定时的溶剂试剂浓度用途主要原理酒精95%(体积分数)除去杂质以提纯DNADNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可溶于酒精二苯胺—鉴定剂DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色柠檬酸钠0.03g/mL抗凝剂除去血液中的钙离子，防止血液凝固2．DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”加蒸馏水2次①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的浓度下降到0.14mol/L，使DNA析出用纱布过滤3次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；③过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②稀释NaCl溶液浓度至0.14mol/L，使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA[考向预测]考查DNA的粗提取和鉴定(素养目标：科学探究)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。(1)图中实验材料A可以是________等，研磨前加入的B应该是____________________。(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2mol/L的NaCl溶液的目的是______________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是_______________________________________。(3)在该实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，其中含DNA最少的是滤液________。1B液中搅拌研磨后过滤滤液E22mol/L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液F30.14mol/L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液G4冷却的95%的酒精溶液中搅拌后过滤滤液H(4)DNA鉴定的原理是_____________________________________。【答案】(1)洋葱(或菜花)洗涤剂和食盐(2)使DNA溶解使DNA(溶解度下降而沉淀)析出(3)H

(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色【解析】(1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨。(2)DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。典题演练·破解高考1．(2020年山东济南模拟)基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因HSV­k1、HSV­tk2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neor，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。(1)构建重组载体时，常用的工具酶有________________________。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞____________。(2)为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的____________取出，并用_______________处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为__________。(3)用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个HSV­tk中至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上。已知含有neor的细胞具有G418的抗性，HSV­tk1、HSV­tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是__________的胚胎干细胞，理由是__________________________________。(4)将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠_____________________________________________________，说明PKU基因成功表达。【答案】(1)限制酶和DNA连接酶具有全能性(2)内细胞团细胞胰蛋白酶或胶原蛋白酶贴壁生长(3)正确互换整合正确互换后的染色体上只有neor，无HSV－tk1、HSV－tk2，具有G418抗性，故能在含有G418和DHPG的培养液中生长，错误互换后的细胞中染色体DNA上含有neor和至少1个HSV－tk，而HSV－tk1、HSV－tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质，故在含有G418和DHPG的培养液中错误整合的细胞死亡(4)尿液中霉臭味显著降低(或没有表现出苯丙酮尿症)【解析】(1)构建重组载体时，常用的工具酶有限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶。实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞具有全能性。(2)为获得小鼠的胚胎干细胞，可将小鼠囊胚中的内细胞团细胞取出，并用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使其分散成单个细胞进行培养，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为贴壁生长。(3)已知含有neor的细胞具有G418的抗性，HSV－tk1、HSV－tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。据分析可知，正确互换后的染色体上只有neor，无HSV－tk1、HSV－tk2，错误互换后的细胞中染色体DNA上含有neor和至少1个HSV－tk，因此，转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是正常互换整合的胚胎干细胞，原因是：正确互换后的染色体只有neor，无HSV－tk1、HSV－tk2，具有G418抗性，故能在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中生长，错误互换后的细胞中染色体DNA上含有neor和至少1个HSV－tk，而HSV－tk1、HSV－tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质，因此在含有G418和DHPG的培养液中死亡。(4)苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出，主要表现为智力低下，尿液中有霉臭味，将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，若PKU基因成功表达，则从个体生物学水平检测，小鼠尿液中霉臭味显著降低。2．(2018年全国新课标Ⅰ卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了____________________________(答2点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的__________方法导入大肠杆菌细胞：而体外重组的噬菌体DNA通常需与__________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是____________。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加____________的抑制剂。【答案】(1)体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶3．(2018年全国新课标Ⅱ卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是__________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。【答案】(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA【解析】(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达，基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。4．(2020年全国新课标Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。(1)步骤①中需要使用的工具酶有______________________。步骤②和③所代表的操作分别是____________和____________。步骤④称为____________。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的____________(答出2点即可)的限制。(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息____________(填“相同”或“不同”)，原因是_______________________________________________。(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有____________(答出2点即可)。【答案】(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶显微注射体外培养胚胎移植(2)性别、年龄(3)相同两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵(4)体外受精、胚胎移植【解析】(1)由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接黏性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物，不受动物的性别和年龄的限制。(3)在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。(4)由分析可知，步骤③为体外培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。名师点睛分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。5．(2020年山东卷)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______________________，

重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为____________。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_________________________________，从而改变了

Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列____________(填“发生