柴胡加龙骨牡蛎汤快速抗抑郁作用及机制研究

柴胡加龙骨牡蛎汤快速抗抑郁作用及机制研究目的确立《伤寒论》经典方剂柴胡加龙骨牡蛎汤的快速抗抑郁作用及机制。通过对不同剂量柴胡加龙骨牡蛎汤快速抗抑郁作用的筛发掘该方剂快速抗抑郁的最优剂量通过拆方研究发掘其快速抗抑郁的核心组建立嗅球摘除抑郁模型评估该抑郁模型的抑郁行为学及前额叶谷氨酸受体机制。证明柴胡加龙骨牡蛎汤通过调节前额叶AMM氨酸受体机制及胞内AKT-路改善神经突触可塑性产生快速抗抑郁作用。戊巴比妥睡眠诱导实验评估柴胡加龙骨牡蛎汤的镇静促眠作用。并进一步通过临床观察确立该方的快速抗抑郁及促眠作用。方法、以汉代两=临床标准以及人与小鼠的用药换算关系分别以柴胡加龙骨牡蛎汤临床常规剂量,3剂量,2剂量及1/4量分为10g/kg,7.5以及kg,5g/kg2.5g/kg量组。首先对10g/kg,7.5三个剂量组在Bal品系正常小鼠上筛查其抗抑郁样作用。在单次给药柴胡加龙骨牡蛎汤2小时后进行抗抑郁行为学筛查实验。即开场自主活动测试悬尾绝望不动时间测试及强迫游泳实验筛选出最佳抗抑郁剂量再以此剂量进行药物的起效时间与作用持久性实验。分别在单次给药后3分钟,小时,时,时及9小时分别行悬尾测试陌生环境摄食测试等行为学筛查确定柴胡加龙骨牡蛎汤快速抗抑郁的最佳有效剂量及持久性同样地方法对7.5g/k5g/k量组在昆明品系小鼠上通过单次给药后2小时的自主活动悬尾绝望不动时间测试及强迫游泳实验筛查发挥快速抗抑郁作用的最小剂量。然后在该最小剂量条件下给药后3分钟,小时,时,时及9小时分别行悬尾测试陌生环境摄食测试实验检测柴胡加龙骨牡蛎汤快速起效的时间及作用持久性。2将柴胡加龙骨牡蛎汤按照不同方药组分的治则治法进行拆方实验。实验共分为空白对照组柴胡加龙骨牡蛎汤全方组小柴胡汤组桂枝茯苓等大黄龙骨牡蛎组小柴胡汤加龙骨牡蛎组以及小柴胡汤加桂枝茯苓大黄组六个实验组别。在各组单次给药的3分钟,时,时及7小时进行悬尾不动时间测试开场行为测试强迫游泳不动时间测试以及陌生环境摄食实验筛查各实验组在不同时间点的抗抑郁样作用以及柴胡加龙骨牡蛎汤发挥快速抗抑郁作用的核心组成部分。3.照文献报道方法及小鼠脑立体定向手册建立嗅球摘除抑郁模型。将小鼠分为空白对照组假手术组、嗅球摘除模型组。运用旷场实验悬尾实验强迫游泳实验及糖水偏好实验评估模型的抑郁行为。然后结合实验的结果以柴胡加龙骨牡蛎汤全方及快速抗抑郁的核心药物组对嗅球摘除模型小鼠单次灌胃给药并分别参以阴性对照生理盐水灌胃、阳性对照氯胺酮30mg腹腔注射干预措施。在完成上述药物处理后2小鼠、4小时及7小时后进行开场行为实验、悬尾绝望实验及糖水偏好实验进一步重复评估柴胡加龙骨牡蛎汤全方以及其核心抗抑郁组分在嗅球摘除模型中的抗抑郁作用。根据筛查结果对在模型上能发挥快速抗抑郁作用的方药进一步行行为学实验验证确立柴胡加龙骨牡蛎汤在嗅球摘除模型小鼠上发挥快速抗抑郁作用的组分。4分子生物学实验基于实验的结果给与嗅球摘除抑郁模型小鼠快速抗抑郁作用的实验药物2小时后牺牲小鼠断头取脑海马及前额叶组织。提取蛋白行Western验检测前额叶AM体亚型GluR1受体亚型NNR、NR的变化对前额叶AKT-信号通路的影响以及海马区BD、Gl的表达变化。5.巴比妥钠睡眠诱导行为学实验以空白小鼠为研究对象参照实验1-3的结果分为戊巴比妥睡眠诱导组柴胡加龙骨牡蛎汤(5g巴比妥组以及柴胡加龙骨牡蛎汤(1Og联合戊巴比妥组分别在柴胡加龙骨牡蛎汤单次给药及重复天给药条件下行戊巴比妥睡眠诱导行为学实验戊巴比妥诱导采取腹腔注射给药形式以引起小鼠扶正反射刚好不消失的最大剂量为阈下剂量以刚好能引起小鼠入睡的最小剂量为阈上剂量柴胡加龙骨牡蛎汤于戊巴比妥给药前3分钟灌胃。首先观察柴胡加龙骨牡蛎汤单次给药、戊巴比妥钠阈下剂量诱导下柴胡加龙骨牡蛎汤对小鼠入睡率的影响然后在戊巴比妥钠阈上剂量诱导下观察柴胡加龙骨牡蛎汤单次给药对小鼠睡眠时间及入睡潜伏期的影响按照同样的实验方法在柴胡加龙骨牡蛎汤重复给药天的最后一次给药后重复上述实验观察多次给药对小鼠入睡率、睡眠潜伏期及睡眠时间的影响。6.床观察研究在临床住院患者中筛选重度单向抑郁症伴失眠患者分为SS氮卓类促眠药西药治疗组以及柴胡加龙骨牡蛎汤加上述同类西药治疗组所有苯二氮卓类药物及新型促眠药均以地西泮等效剂量换算最终换算为地西泮剂量在试验的第1,24HA表评估比较两组之间在迟滞因子、焦虑躯体化因子及睡眠因子从改善情况以及第1进行PS表评估,进一步评估柴胡加龙骨牡蛎汤对失眠的作用并且评估两治疗组对促眠西药用量的影响。结果:胡加龙骨牡蛎汤1Og/kg,7.5三个用药剂量在lb/c品系小鼠上单次给药2小时后对小鼠开场自主活动无明显影响仅5gg组能够降低小鼠悬尾绝望不动时间三个剂量组对强迫游泳不动时间均没有明显影响柴胡加龙骨牡蛎汤(5g药3分钟,小时,时后均能够明显降低小鼠悬尾绝望不动时间结果与氯胺酮相似而在给药9小时后仅氯胺酮降低了悬尾绝望不动时间。在4小时的陌生环境摄食实验中柴胡加龙骨牡蛎汤及氯胺酮均明显降低了小鼠摄食潜伏期提高了小鼠的摄食量。柴胡加龙骨牡蛎汤1Og/kg,5g/三个剂量在昆明品系小鼠上单次给药2小时后对小鼠开场自主活动无明显影响;5g组能够明显降低悬尾绝望不动时间及强迫游泳不动时间;1O仅能降低强迫游泳不动时间。在给药4小时的陌生环境摄食实验中柴胡加龙骨牡蛎汤10g/kg5g/kg量组均能够降低小鼠摄食潜伏期但10g组的小鼠摄食量降低继续以柴胡加龙骨牡蛎汤5g进行药效的快速及持久性测试发现在柴胡加龙骨牡蛎汤(5g药后3分钟,小时,时均能够明显降低小鼠悬尾测试不动时间结果与氯胺酮相似。2.胡加龙骨牡蛎汤全方及拆方各实验组在单次给药3分钟及4小时后,仅全方组及小柴胡汤组能够明显降低悬尾绝望不动时间给药后2小时强迫游泳实验中柴胡加龙骨牡蛎汤全方组、小柴胡汤组及小柴胡加桂枝茯苓大黄组均能降低小鼠的强迫游泳不动时间而桂枝茯苓大黄龙骨牡蛎对强迫游泳不动时间没有明显影响在给药后第7小时的陌生环境摄食实验中仅柴胡加龙骨牡蛎汤全方小柴胡加龙骨牡蛎小柴胡加桂枝茯苓大黄三个组降低了小鼠的摄食潜伏期而小柴胡汤组及桂枝茯苓大黄龙骨牡蛎组对摄食潜伏期没有明显影响。3.空白组及假手术组比较模型组小鼠的糖水偏好自嗅球摘除术后周开始明显下降术后的第1的糖水偏好值均低于空白对照组直至术后第四周恢复正常。与空白对照组相比嗅球摘除模型小鼠在开场自主活动行为学上表现出活动的总路程增多在分别给与柴胡加龙骨牡蛎汤全方及小柴胡汤处理后的2小时,时及7小时行开场实验悬尾实验及糖水偏好实验中柴胡加龙骨牡蛎汤全方、小柴胡汤对小鼠的开场自主活动无明显影响但小柴胡汤组降低了小鼠的中央活动时间仅柴胡加龙骨牡蛎汤全方实验组在单次给药2小时、72小时后能够降低小鼠悬尾绝望不动时间并且在4小时的糖水偏好测试中明显提高了小鼠的糖水偏好百分比作用与氯胺酮相似。进一步的行为学验证发现柴胡加龙骨牡蛎汤在嗅球摘除抑郁模型小鼠上单次给药2小时后降低小鼠的悬尾绝望不动时间作用持续至7小时并且在48小时的糖水偏好及陌生环境摄食实验中柴胡加龙骨牡蛎汤能够提高小鼠的糖水偏好比值降低摄食潜伏期增加摄食量结果与氯胺酮相似。4与空白对照组相比嗅球摘除抑郁模型小鼠的前额叶谷氨酸AM体亚型Gl明显降低,而NM体亚型NNR、AR达上调并且嗅球摘除模型小鼠明显抑制了胞内AKT-及信号通路柴胡加龙骨牡蛎汤能够降低模型小鼠前额叶NNR、NR的表达提高GluR1达从而提高AMPAR/NMDAR同时能够提高AKT-磷及下游Gl达水平。我们还发现与空白对照组相比嗅球摘除抑郁模型小鼠的海马脑区,Gl、R1BD白水平升高柴胡加龙骨牡蛎汤能够进一步提高海马区Gl达而对BD平无明显影响结果与氯胺酮相似5.胡加龙骨牡蛎汤(10g/kg)给药条件下能够延长小鼠的睡眠时间并且有降低入睡潜伏期的趋势重复给药天后能够提高小鼠的入睡率降低小鼠的睡眠潜伏期并且有延长睡眠时间的趋势。6在单向重度抑郁症伴失眠患者中柴胡加龙骨牡蛎汤联合西药治疗组在治疗1时HA分与对照组无显著性差异但在迟滞因子睡眠障碍因子评分是均较对照组明显下降进一步的PS眠量表评定显示柴胡加龙骨牡蛎汤联合治疗组在PS评分以及入睡时间、睡眠效率、日间功能障碍、催眠药物四个因子方面具有显著得改善在辅助治疗药物方面柴胡加龙骨牡蛎汤联合西药治疗组新型促眠药的等效地西泮应用剂量为3.6新型促眠药的等效地西泮应用剂量为4.5间的差异存在统计学意义柴胡加龙骨牡蛎汤联合西药治疗组苯二氮卓类药物的等效地西泮应用剂量为27组苯二氮卓类药物的等效地西泮应用剂量为29之间无明显差异。结论1.胡加龙骨牡蛎汤(5g品系小鼠上单次给药3分钟后均可产生稳定的快速抗抑郁样作用且作用持久天效果与氯胺酮相似2.胡加龙骨牡蛎汤全方及小柴胡汤均表现出快速抗抑郁样作小柴胡汤是全方发挥快速抗抑郁作用的核心。桂枝茯苓大黄龙骨牡蛎部分虽没有单独表现出抗抑郁样作但是可能对柴胡加龙骨牡蛎汤全方抗抑郁的持久性有重要意义3.球摘除抑郁模型小鼠具有很好的模型稳定性。柴胡加龙骨牡蛎汤在嗅球摘除抑郁模型上表现出稳定的抗抑郁作而小柴胡汤没有在该模型中表现出抗抑郁作用且可能有致焦虑样行为反应。4.球摘除模型小鼠前额叶谷氨酸受体AMPARAKT相关信号通路的抑制这可能是导致其抑郁表现的内在机制柴胡加龙骨牡蛎汤能够提高嗅球摘除模型小鼠前额叶AMPA值上调