三维荧光光谱技术监测硅藻类蛋白荧光强度的变化规律

三维荧光光谱技术监测硅藻类蛋白荧光强度的变化规律

荧光溶解有机物微藻特征海洋灯溶解有机物质是海洋灯溶解有机物的重要组成部分。它以广泛的来源收集通道，主要是河流输送、降水等外源，生物活动和海上积累间隙水的释放。海洋浮游植物为其重要的生物来源,尤其是在赤潮发生过程中,曾发现较强的荧光。现对微藻本体的荧光特性已有诸多研究,但对藻体生长过程所产生的荧光溶解有机物的研究比较匮乏,研究发现微藻生长过程中的溶解有机物会产生类蛋白荧光和类腐殖质荧光,藻种不同,所产生的三维荧光光谱特征也不同。三维荧光光谱法测定荧光溶解有机物具有很好的优点,已得到广泛应用。本研究是在实验室受控条件下培养6种微藻,并利用三维荧光光谱技术监测微藻不同生长阶段产生的荧光溶解有机物,分析不同微藻在不同生长阶段荧光峰的位置、强度及类型的相似点及不同点,以期深入了解微藻产生的溶解有机物的荧光特征及与生长过程的关系。对于监测赤潮的藻种及密度具有很大帮助。1材料和方法1.1营养盐的添加量藻种均取自于中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室藻种库。培养体系为2L海水(0.45μm醋酸纤维膜过滤,120℃灭菌30min)于透明玻璃瓶中,按f/2配方添加营养盐,在光暗比为12h∶12h,温度(23±1)℃条件下于培养架上培养。藻细胞密度的测定是根据藻液稀释比例与吸光度的关系计算所得。1.2维荧光光谱的测定定时取样测定藻细胞密度,按一定时间取一定体积藻液用GF/F(Whatman)玻璃纤维膜(450℃灼烧4h)抽滤,滤液于棕色玻璃瓶中避光冷冻保存,并尽快用HITACHIF-4500型荧光分光光度计测定三维荧光光谱,其方法参见本实验室以往的工作,激发波长、发射波长分别设为200～550nm,250～650nm。2结果与讨论2.1塔玛各藻的种类微藻经过一段时间均迅速进入指数增长期,中肋骨条藻为24d;塔玛亚历山大藻为40d;微小亚历山大藻为49d;锥状斯氏藻为59d;东海原甲藻为34d;海洋原甲藻为49d。除锥状斯氏藻外其他藻种均在藻密度达到最大后几天进入消亡期。2.2不同培养阶段的海藻溶液的三维荧光特性2.2.1荧光溶解有机物测定结果微藻藻种不同,产生荧光物质也不同,实验结果显示六种微藻不仅藻种之间产生的荧光溶解有机物不同,并且微藻在各个生长阶段的主要荧光溶解有机物也不同,如表1所示。2.2.2不同生长阶段的微藻三维荧光特征(1)荧光等值线法确定a峰表1和图1显示,中肋骨条藻具有T,S,A,C峰,主要为A和C峰,并且T和S峰被覆盖。观察到A峰拉得比较长,文献报道单一化合物的荧光等值线图为圆形,由此判断A峰由混合物组成,并且实验发现A峰主要有255/455nm和260/480nm两个最大荧光峰。消亡期A峰和C峰荧光强度迅速增大,原因可能是细菌降解和光降解等。(2)t,s,a,c峰表1显示,同属藻种海洋原甲藻与东海原甲藻主要荧光峰相同,指数生长期均有T,A,M峰,而进入平台期和消亡期后变为T,S,A,C峰,如图2和图3所示。另外海洋原甲藻相对东海原甲藻A峰、C峰蓝移,这可能与荧光物质的丰度有关,研究发现荧光物质蓝移和红移与每一物质的相对丰度有很大关系。另外M峰向C峰的转化可能是由于类腐殖质的老化而使M峰红移;研究发现高生产的表层海水类腐殖质荧光峰主要出现在M区,而深层的则移向C区,C峰相对M峰为相对老的物质荧光峰。(3)指数增长期类色氨酸锥状斯氏藻生长缓慢,在实验阶段只进入平台期,表1及图4显示在指数增长期主要有类色氨酸T,S,A,M峰。进入平台期时,T峰和S峰强度进一步增大,A峰和M峰强度也有所增大,但是与T峰、S峰相比强度较低,并且两者的强度相差不大。(4)荧光峰位置及峰形状属于同属藻种的微小亚历山大藻与塔玛亚历山大藻荧光峰谱图相似(见图5和图6)。表1显示,两者在指数生长期时主要荧光峰位置及峰的形状均相近。到平台期时,均出现明显的T,S,M峰。塔玛亚历山大藻出现明显的A峰,并且激发和发射波长与指数生长期相比均红移了20nm左右。消亡期时各微藻谱图中的峰位置变化不大,但是两种微藻M峰位置明显不同(如表1所示)。另外微小亚历山大藻各荧光峰强度均远大于塔玛亚历山大藻。2.3藻密度对指数生长和测定的影响浮游植物在生长过程中能产生类蛋白荧光物质,荧光强度与藻密度应该有一定的相关性。本研究用类色氨酸T峰代表类蛋白荧光发现其荧光强度与藻密度之间具有类似的关系。微小亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、东海原甲藻及海洋原甲藻类蛋白荧光峰强度在指数增长期随着藻密度的增大而增大,呈明显的线性正相关(相关系数分别为:r=0.8967,p<0.0005;r=0.8919,p<0.0005;r=0.8991,p<0.0005;r=0.9378,p<0.0001),在藻密度达到最大时,荧光强度持续增大一段时间后开始降低,仍呈正相关。中肋骨条藻在指数生长期荧光强度与藻密度呈线性正相关(r=0.9197,p<0.0005,n=10),在消亡期藻密度呈明显的负相关。锥状斯氏藻只培养到平台期,峰强度与藻密度同样呈现明显的线性正相关(r=0.9761,p<0.0001,n=12)。结果表明,不同生长阶段微藻藻液显示不同荧光特性,根据类蛋白荧光强度变化可以判断微藻藻密度的变化,在实际赤潮监测中分辨藻种以及藻密度。3荧光溶解有机物的c峰特征(1)微藻在生长过程中能产生荧光溶解有机物。甲藻产生的主要是类蛋白荧光物质,而硅藻产生的主要为类腐殖质荧光物质。同属微藻能够产生类似荧光物质,但荧光峰位置有所不同。(2)甲藻在生长阶段产生的类色氨酸荧光溶解有机物,在消亡期达到最大,随后由于细菌降解和光降解因素其含量降低。而类腐殖质荧光溶解有机物在微藻生长阶段荧光强度低于类色氨酸荧光强度,而在消亡期迅速增大,强度高于类