沼液培养小球藻对co

沼液培养小球藻对co

人类工业生产产生了大量的co2。气氛中co的浓度从28010-6号变为38010-6。这也是世界转型的主要原因。因此，控制co排放已成为各国政府、学术界和学术界的热点之一。微藻具有生长速度快、适应性强、光合速度快等优点。在光合作用过程中，可以固定大量的co。其捕获效率是植物的10.50倍。解决co排放的全球问题具有重要的应用价值。国内外有很多关于微藻固定co和污水处理的报告，但很少有研究利用微藻来固定co和污水处理。利用废水培养微藻，不仅可以节省微藻的固定成本，还可以有效清除水中的各种污染，尤其是氮、磷等营养成分[4.7]。沼气厌氧发酵生产的粗沼气除甲烷外主要含有20%~40%的CO2,发酵过程中产生了大量的发酵残留物沼液和沼渣,其中沼液中含有丰富的氮、磷等元素,直接排放会引起水体的富营养化.如果把沼气发酵和微藻培养结合起来,即利用沼气中的CO2作为微藻培养的碳源,沼液作为培养微藻的营养来源,不仅能利用微藻净化沼气固定CO2,还可对沼液进行脱氮除磷,有效降低微藻的培养成本,达到显著的环境效益和双重的经济效益.本文利用沼气发酵产生的废液作为小球藻的培养基,以CO2和空气的混合气体模拟粗沼气,考察了不同的通气条件对小球藻生长以及CO2去除效率及去除量的影响,最后考察了小球藻对粗沼气中的CO2的去除,以期为小球藻法去除粗沼气中或其他废气中的CO2提供研究基础.1材料和方法1.1藻种的保存方式实验藻种为普通小球藻(Chlorellavulgaris),由暨南大学张成武教授提供.保种用的培养基均采用BG11培养基:NaNO31.5gL-1,K2HPO4·3H2O0.04gL-1,MgSO4·7H2O0.075gL-1,CaCl2·2H2O0.036gL-1,Na2CO30.02gL-1,柠檬酸0.006gL-1,柠檬酸铁0.006gL-1,2Na·EDTA0.001gL-1,微量元素H3BO30.061mgL-1,MnSO4·H2O0.169mgL-1,ZnSO4·7H2O0.287mgL-1,CuSO4·5H2O0.0025mgL-1,钼酸铵0.0125mgL-1.藻种保存方式有室温弱光静置保种(每天摇2~3次)和平板4℃冰箱放置保种,平板培养基在液体培养基中加入2%的琼脂.1.2沼液的基本营养成分测定培养基采用南京工业大学国家生化工程技术研究中心沼气示范工程沼气发酵后的废液为基础培养基.沼液经过沉降池,去除较大的固体颗粒,再经过板框压滤机过滤后,去除较小的颗粒,储存在废液池中备用.分别采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法、钼酸铵分光光度法、等离子发射光谱法测定总氮、总磷、金属离子浓度[9~10],沼液中各成分含量如表1所示,其初始pH值在8.5左右.可以看出,沼液含有微藻生长所需的基本营养成分,可以考虑作为微藻的基础培养基.1.3空气源采用空气和钢瓶混合系统如图1所示,微藻是在自行设计的简易光生物反应器中进行培养的,光生物反应器为内管径3cm,管长度55cm,厚度0.3cm,工作装液量300mL的长玻璃管,经高压蒸汽灭菌后使用.来自空气泵的空气和钢瓶中的CO2在缓冲瓶混合均匀后,通过硅胶管连接到光生物反应器供气.分别通过调节控制CO2、空气流速的两个转子流量计,从而在气流中达到所需的CO2浓度.1.4小球藻的生长采用日光灯作为光源,光照强度5500lx,光暗比18:6,培养温度为25~28℃.将小球藻接种到煮沸冷却后的沼液培养基中,起始接种藻液的A680nm在1.0左右,通气量为200mLmin-1培养14d,每天对其生物量进行测量.1.5沼液光吸收值的测定光吸收值法:取1mL小球藻藻液,用蒸馏水适当稀释后,以蒸馏水为空白对照,测定其在680nm下的光吸收值.取平均值乘上稀释倍数再减去沼液的光吸收值进行修正,以此衡量小球藻的生物量.干重法:取适量小球藻藻液,8000rmin-1离心,烘干后称重.干重与光吸收值的线性关系为:Dryweight(gL-1)=0.2398A680nm-0.0858,R2=0.9987.1.6气体污染物去除率和去除co向藻液中通入CO2和空气混合气体,用4L气体取样袋分别收集通入藻液的混合气体和经藻液利用后的气体,通过CO2红外气体分析仪测量取样袋中气体的CO2浓度,重复测定3次.根据通气流量和通入气体与流出气体的CO2浓度变化算得小球藻对CO2的去除率和去除量.2结果与讨论2.1沼液培养:小球藻的培养基沼液中虽然含有适合小球藻生长的基本营养成分,但其浊度、pH值较高,对小球藻的生长有不利影响.小球藻直接接种于沼液后出现不适应,藻细胞大量死亡.为使小球藻适应沼液中的生长环境,需要进行一段时间的藻种驯化步骤将沼液用BG11培养基稀释至10%浓度,使小球藻在此混合培养基中有良好生长,然后将沼液浓度提高到25%.再改用自来水稀释沼液至25%浓度,并逐步提高沼液浓度,最终使小球藻在沼液培养基中能良好生长.未经稀释的沼液浊度较高,不利于光的透过,影响小球藻的光合作用.此外沼液中营养盐浓度较高,还悬浮着一些不溶的营养成分,过浓的沼液不利于小球藻的吸收利用.而过于稀释沼液会降低培养基中的营养,使小球藻的生长受到营养限制,因此需要选取一个培养小球藻的合适沼液浓度.以BG11培养基为对照,考察了小球藻在25%、50%、75%、100%4个浓度组的沼液中生长的情况,每组作2个平行培养.从图2中可以看出,小球藻在高浓度的沼液中生长较慢,停滞期较长为6~7d.在BG11培养基和低浓度沼液中生长较快,停滞期只有1~2d.这说明过高的沼液浓度对小球藻的生长有显著的抑制作用.在25%和50%浓度沼液中生长的小球藻最终生物量都高于在BG11培养基中生长的小球藻,而高浓度沼液经过较长的停滞期后也能达到与BG11培养基中小球藻相当的生物量.这可能是因为小球藻只能利用BG11培养基的无机营养成分进行自养.而沼液培养基来自于沼气发酵的废液,含有的大量有机物质能促进小球藻的生长,小球藻在沼液中为自养和异养共存的混养模式.小球藻对不同浓度沼液中氮磷营养盐利用情况如表2.沼液经过小球藻利用后,其氮磷含量大幅下降,小球藻对25%、50%、75%、100%沼液中氮的去除率均达到了90%以上,小球藻对各浓度沼液中总磷的去除率均达到了97%以上.经小球藻利用后的沼液中的最终总氮浓度小于20mgL-1,总磷浓度小于1mgL-1,已达到城镇污水处理氮磷排放国家一级标准的B标准.化学需氧量以100%沼液计,由903mgL-1降为163mgL-1,去除率为82%.因此,利用沼液作为小球藻的培养基不仅能节约用水、净化沼液缓解环境压力,还能促进小球藻生长,提高生物量,此实验方案可行.25%浓度沼液由于被大量稀释,营养成分不足,小球藻的最终生物量低于50%浓度沼液中的小球藻.因此接下来的实验中均选取50%浓度沼液作为小球藻的培养基.2.2小球藻的生长CO2是光合作用的底物,提高CO2浓度有助于微藻对水中无机碳的光合同化,促进其光合作用.但是随着CO2浓度增加,水中大量的溶解态CO2向细胞质膜内扩散,并水解形成HCO3-和H+,造成胞内pH值下降,这种酸化对微藻细胞质的“毒性”作用会阻碍微藻对CO2的吸收和利用.此外高浓度的CO2会抑制微藻细胞碳酸酐酶(CA)活性以及碳浓缩机制(CCM)的形成.但许多研究表明,小球藻对高浓度的CO2具有较强的耐受性.K.D.SUNG等人从取自热电厂附近的水样中分离出Chlorellasp.KR-1,在10%~50%浓度CO2条件下均能良好生长.将通空气改为通1.5%CO2,培养8~10d后重新接种培养,循环数次待小球藻逐渐适应后,以此为藻种,50%沼液为培养基,向同时接种的6组小球藻藻液中分别通入200mLmin-1的空气和不同浓度的CO2,每组作2个平行培养,每天测量各组小球藻生物量,考察最适宜小球藻生长的CO2浓度和小球藻对高浓度CO2的耐受能力.从图3-a中可以看出,与通空气组相比,通入不同浓度的CO2气体对小球藻的生长都有显著的促进作用,其中小球藻在0.5%、1.5%CO2通气中生长较快,几乎没有停滞期,整个生长期间藻液的pH维持在为7.5~7.7、7.0~7.2.而在5%、10%、20%CO2通气中,小球藻有1~2d的停滞期,此时其pH分别为6.4~6.7、6.2~6.4、5.6~6.0.可以看出20%CO2通气下其pH值已经接近CO2饱和溶液,正是因为高浓度CO2对小球藻的酸化作用,导致小球藻生长受到抑制.随着生物量的增加,小球藻对无机碳的光合同化有所提高,部分中和了高浓度CO2的酸化作用.5%、10%、20%CO2通气下的小球藻进入对数生长期后其pH值有所升高,分别为6.7~7.0、6.4~6.7、6.2~6.4,最终生物量仍明显高于通空气生长的小球藻.Sheng-YiChiu等人的研究结果也表明,接种浓度较低时,小球藻在10%~15%的高浓度CO2几乎没有生长;而藻液中生物量较高时,小球藻能够适应10%~15%的高浓度CO2而良好生长.向同时接种的6组小球藻藻液中分别通入不同流量的1.5%CO2气体,每组作2个平行培养,每天测量各组小球藻生物量,其变化曲线如图3-b.可以看出,通气量在120mLmin-1以下时提高通气量对小球藻的生长有一定的促进作用.因为提高通气量除了具有促进气液传质、温度与营养均匀分布、防止藻细胞沉降等作用外,还可以使藻细胞在与光生物反应器表面受光的这个方向上能充分混合,使藻细胞受光均匀.当通气量达到120mLmin-1以上时,藻液已经达到充分混合,再进一步提高通气量已不能对小球藻生长起到明显的促进作用.刘玉环等人的研究也表明通气量对微藻生长的促进是有限的,通气量在6Lmin-1(相应培养体积为10L)以下时提高通气量可以促进微藻生长,当通气量达到9Lmin-1时反而对微藻的生长有所抑制.2.3小球藻对co的光合同化在CO2浓度1.5%,通气量100mLmin-1,50%沼液培养的条件下,考察了CO2去除随小球藻生物量增长的变化趋势.如图4-a所示,CO2去除量先是随小球藻生物量增长而迅速提高.在小球藻培养到d3,D680nm为5.0左右时,达到去除量峰值150.86mgL-1h-1(每小时每升藻液去除的CO2),然后随小球藻生物量的增长而逐渐降低.EduardoJacob-Lopes等利用精炼厂废水培养蓝藻Aphanothecemicroscopica,研究发现随着生物量的增长,微藻对CO2的吸收在96h时达到峰值18.7mgL-1min-1,同样也呈现先增大后减小的趋势.这种变化趋势与小球藻在停滞期生长速率较慢,在对数期生长速率最快,而在稳定期逐渐停止生长的现象相吻合:小球藻处于停滞期时,生物量较低,其光合作用所吸收的光能远小于照射于藻液的光能,随着细胞浓度增加,光合作用所吸收的光能增大,促进了小球藻对CO2的光合同化;当小球藻进入对数生长期时,光合作用所吸收的光能逐渐达到饱和,同时细胞大量的分裂充分利用了光合作用中固定的碳,小球藻对CO2的吸收达到最大值;进入稳定期后,细胞浓度再进一步增大,由于藻液中小球藻互相遮挡,单位细胞体积能接受到光能的细胞表面积减少使得小球藻不能充分进行光合作用,小球藻生长分裂速度变慢,再加上小球藻生物量增大其呼吸作用产生的CO2可能也会影响小球藻对CO2的吸收.因此,提高小球藻生长速率可以促进对CO2的去除.将通气量控制在100mLmin-1,小球藻D680nm在5左右,考察了通入不同浓度CO2对小球藻吸收CO2的影响.如图4-b所示,随着CO2浓度的增加,小球藻对CO2的去除率先增加后急剧减少,在1.5%有最大去除率26.68%.CO2去除量则呈对数增加,在10%CO2有最大吸收值279.7mgL-1h-1.这是由于当CO2浓度较低时,气相与液相之间CO2的浓度差较小,CO2溶解的推动力较小,藻液中CO2的浓度没有达到饱和;而随着CO2的浓度增大时,CO2溶解于藻液速率增大,从而使去除量增大但是小球藻脱除CO2的能力有限,去除量增大的幅度越来越平缓,再提高CO2浓度已经不能增加小球藻的CO2去除量,反而使得去除率相对减小.提高CO2浓度虽然能促进小球藻对CO2的固定量,但却对小球藻的生长有抑制作用.Sheng-YiChiudengren等在光生物反应器半连续培养小球藻,也发现了同样的现象,对2%、5%、10%、15%浓度CO2通气的去除量分别为0.261、0.316、0.466、0.573gh-1,但小球藻的增长速率却无明显的差别.EduardoJacob-Lopes等人的研究表明,蓝藻AmicroscopicaNägeli对15%浓度CO2通气的平均去除量为(700±42)mgL-1h-1,而被有效固定到生物量中的CO2只占CO2总固定量的3.1%±0.05%.这也表明在光生物反应器中可能存在其他的CO2转化途径,如生物聚合物的排泄,以及挥发性有机化合物的释放等.在小球藻D680nm在5左右的条件下,考察了通入不同流量的1.5%浓度CO2对小球藻吸收CO2的影响.如图4-c所示,随着通气量的增大,小球藻对CO2的去除率逐渐减少.因为气流量越低,小球藻脱除的CO2占气体比例越大,脱除率相对越高.而小球藻对CO2的去除量随着气流量的增大,去除量先增加后减少,但是变化程度不大.在60mLmin-1处小球藻有峰值吸收.高春燕等在相似条件下考察了不同气流量对小球藻吸收CO2的影响,结果同样表明去除率随流量增大而减小,去除量先增大后减小的变化趋势.这与通气量对小球藻生长的影响也比较符合:在通气量180mLmin-1以下时,提高通气量使得藻液在受光方向上均匀混合,提高了小球藻对照射于藻液上光能的利用率,增加了对CO2的去除,一定程度上促进了小球藻的生长.2.4小球藻对粗沼中co的去除效果从前面的研究可以看出,在20%CO2通气下,初期藻液pH值降至与CO2饱和溶液同一水平.但小球藻在此条件下仍然有较好的生长,并随着生物量的提高部分中和了高浓度CO2的酸化作用,小球藻对高浓度的CO2具有较强的耐受性.但随着CO2浓度增高,小球藻对CO2的去除效率明显下降,而降低通气可以大大提高CO2去除率.南京工业大学沼气示范工程中粗沼气中CO2浓度约为28.95%±0.43%,其余成分为甲烷.每立方米沼气发酵体积的最大产气量约为4m3d-1,相应产气体积比仅为0.003vvm,因此降低通气量可以满足小球藻对粗沼气中CO2的去除.以100%沼液为培养基,小球藻A680nm在5左右,将通气体积比调整0.06vvm,通气量约为18mLmin-1,考察了单管培养小球藻对粗沼气中CO2的去除,去除量可达(222.32±19.04)mgL-1h-1,由于粗沼气中CO2浓度较高,去除率仅为10.86%±0.93%.采用六管串联通气培养,藻液总体积提高为1.8L,通气量仍为18mLmin-1.在此条件下,最终出气的CO2浓度为11.49%±1.12%,CO2去除率为60.32%±3.73%,去除量为(205.80±13.20)mgL-1h-1,小球藻对粗沼气中CO2达到了良好的去除效果.3小球藻对co的去除本研究将利用微藻固定CO2与污水处理结合起来:利用营养丰富的沼液培养微藻,在固定CO2