色谱法Tswett叶绿素分离试验课件

第8章经典色谱分离实用技术学习目标知识目标掌握吸附薄层色谱和纸色谱分离原理、常用分离参数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色谱、经典柱色谱的色谱条件选择原则。技能目标掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。

第8章经典色谱分离实用技术学习目标第1节色谱法概述

一、色谱法

Tswett叶绿素分离实验第1节色谱法概述一、色谱法Tswett叶绿素分离实验（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七色光带的现象（2)色谱法：用于产生色谱的分离方法（3）色谱柱（chromatographiccolumn）装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管）

（4)固定相（stationaryphase）

（5）流动相（mobilephase）

液体流动相气体流动相超临界流体流动相固体固定相液体固定相（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七色光带的(6）色谱分离本质:利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力（如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同，而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离的定性与定量分析的方法。二、色谱法分类1.流动相状态液相色谱(LC)气相色谱(GC)超临界流体色谱(SFC)液-固色谱(LSC)液-液色谱(LLC)气-固色谱(GSC)气-液色谱(GLC)(6）色谱分离本质:二、色谱法分类1.流动相状态液相色谱(L2.按分离原理分类吸附色谱分配色谱（DC）离子交换色谱（IEC)分子排阻色谱(MEC）亲和色谱3.根据实验操作形式柱色谱(CC）平面色谱(PC）薄层色谱（TLC）纸色谱（PC)薄膜色谱（TFC）2.按分离原理分类吸附色谱3.根据实验操作形式柱色谱(C三、色谱法的特点分离效能高

分离与分析功能兼备自动化程度高应用范围广三、色谱法的特点分离效能高分离与分析功能兼备自动化程度高第2节经典柱色谱技术

一、液-固吸附柱色谱技术1．分离原理（1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液体的柱色谱法（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中停留的时间即保留时间）不同而达到分离。（3）应用:分离酸性及中性化合物

(如醇类和芳香烃等)

第2节经典柱色谱技术一、液-固吸附柱色谱技术1．分离原理2．吸附剂（1）硅胶(SiO2·XH2O)A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用B.吸附活性

C.失活或脱活

D.活化

硅胶活性与含水量的关系

硅胶含水量%活度级活性0I大小5II15III25IV38V2．吸附剂（1）硅胶(SiO2·XH2O)硅胶活性与含水量（2）氧化铝A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用B.活性

氧化铝含水量%活度级活性0I大小5II15III25IV38V（2）氧化铝A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键C.氧化铝分类及应用范围

氧化铝种类pH应用范围碱性氧化铝9～10分离碱性和中性化合物，如生物碱。中性氧化铝7.5分离酸性、中性和碱性化合物，如生物碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱中不稳定的酯类、苷类等化合物。酸性氧化铝4～5分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸性色素。C.氧化铝分类及应用范围氧化铝种类pH应用范围碱性氧化铝9（3）聚酰胺A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化合物形成氢键而产生吸附作用B.应用范围：适合于含-OH的天然产物的有效成分分离（4）大孔吸附树脂

A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯化（3）聚酰胺A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基3．流动相(又称为洗脱剂)（1）流动相影响因素A.被测物质的结构、性质物质的结构

常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃＜烯烃＜醚类＜硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜酰胺＜醇类＜酚类＜羧酸类。B.流动相极性:

相似相溶C.吸附剂活性官能团极性与数目结构空间排列3．流动相(又称为洗脱剂)（1）流动相影响因素官能团极性与（2）如何选择流动相？最佳方案总是实验确定

想一想

在吸附色谱中，以硅胶为固定相，当用三氯甲烷为流动相时，样品中某些组分保留时间太短，若改用三氯甲烷–甲醇（1:1）时，则样品中各组分的保留时间是变长，还是变得更短？为什么？（2）如何选择流动相？最佳方案总是实验确定想一想在吸4．吸附柱色谱操作技术（1）装柱

A.质量要求装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚0.5~1cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10~20:1。色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。B.装法①湿法装柱②干法装柱4．吸附柱色谱操作技术（1）装柱（2）加样

①干法加样②湿法加样（3）洗脱

①洗脱剂一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂②操作要求A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流B.控制洗脱剂的流速（5～10滴/min)（2）加样①干法加样（3）洗脱（4）收集①等份收集(亦可用自动收集器)②按变换洗脱剂收集（5）检验可以为后续操作（4）收集①等份收集（5）检验色谱法Tswett叶绿素分离试验课件二、凝胶柱色谱技术1．分离原理（1）凝胶(2)分离原理

凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当，尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥先流出色谱柱。尺寸小的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，最后流出。

二、凝胶柱色谱技术1．分离原理（1）凝胶2．固定相(1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻璃珠性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低(2)有机凝胶又称半硬质凝胶性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。(3)新型凝胶---葡萄聚糖凝胶2．固定相(1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻3．流动相（1）要求流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散(2）选用方法水溶性样品-------水溶液为流动相非水溶性样品------有机溶剂为流动相(3）常用的流动相四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和水等3．流动相（1）要求4．凝胶柱色谱操作技术（1）溶胀（2）装柱（3）加样（4）洗脱（5）再生用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质交联葡萄糖凝胶---温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠的混合液浸泡，用水冲洗到中性聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶--盐溶液浸泡，用水冲到中性

4．凝胶柱色谱操作技术（1）溶胀第3节薄层色谱分离检测技术一、分离原理

薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点

薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC)

将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法可分为吸附、分配、分子排阻色谱法等第3节薄层色谱分离检测技术一、分离原理薄层色谱法(thi二、薄层色谱参数1．比移值(1）定义

组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比(2)计算方法二、薄层色谱参数1．比移值(2)计算方法2．相对比移值(1）定义

指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比(2）计算方法(3）特点消除系统误差，值的重复性和可靠性都比好2．相对比移值(1）定义(2）计算方法(3）特点3．分离度（1)定义衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度）的比值

(2）计算方法3．分离度（1)定义(2）计算方法三、仪器与材料1．吸附剂粒径5~40硅胶聚酰胺微晶纤维素氧化铝硅藻土常用硅胶H硅胶G硅胶GF254硅胶HF254

想一想

H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？三、仪器与材料1．吸附剂粒径5~40硅胶聚酰胺微2．载板玻璃板塑料膜金属箔厚度2mm规格5cm×20cm10cm×10cm10cm×15cm10cm×20cm

种类要求

表面光滑、平整清洁玻板处理措施清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用2．载板玻璃板塑料膜金属箔厚度2mm规格5cm×203．点样器手动全自动点样仪定量毛细管

平口微量注射器

3．点样器手动全自动点样仪定量毛细管平口微量注射器3．展开容器平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸3．展开容器平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸4．显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有机化合物喷雾加热多数加热后呈黑色碘多数有机化合物薰蒸多数显黄棕色磷钼酸乙醇溶液醛等还原性物质喷雾烘干蓝色茚三酮试液氨基酸类喷雾或浸渍紫色或黄色三氯化铁-铁氰化钾试液含酚羟基化合物喷雾或浸渍红褐色或棕红色4．显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有5．显色装置喷雾瓶浸渍槽蒸气熏蒸----双槽展开缸

5．显色装置喷雾瓶浸渍槽蒸气熏蒸----双槽展开缸6．检视装置紫外分析仪(三用)摄像设备薄层色谱扫描仪(CS9301型）6．检视装置紫外分析仪(三用)摄像设备薄层色谱扫描仪(CS四、操作技术1．薄层板制备自制薄层板

市售薄层板无黏合剂分类含黏合剂10%～15%煅石膏0.2%～0.5%羧甲基纤维素钠水溶液

操作方法普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)高效薄层板（固定相粒径为5~7）分类操作方法临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁四、操作技术1．薄层板制备自制薄层板市售薄层板无黏合剂分操作方法将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm～0.3mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用。手动涂布器

操作方法将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵2．点样

普通板点样基线----距底边2.0cm

圆点状----

R≤3mm条带状-----宽度5～10mm

点或条带间距----＜8mm

点样量----＜10高效板点样基线----距底边0.8~1cm

圆点状----

R≤2mm条带状-----宽度4～8mm

点或条带间距----＜5mm

点样量----＜52．点样普通板高效板3.展开（1）展开要求

查阅A.何为边缘效应?何因?如何防止?B.展开剂加入量?展开剂展开距离?（2）展开方式上行近水平双向多次3.展开（1）展开要求查阅A.何为边缘效应?上行展开近水平展开上行展开近水平展开4．检视有色物质斑点----目光检视无色物质斑点荧光检出法化学检出法

五、检测技术1．系统适用性试验检测灵敏度比移值

分离效能

4．检视有色物质斑点----目光检视无色物质斑点荧光检出法2．鉴别等浓度对照法----同板---大致同位、同大、同色泽等体积混合法----斑点单一、紧密结构相似对比法-----Rf不同或两斑点3．杂质检查

杂质对照品法

样品溶液的自身稀释对照法

二者合用法2．鉴别等浓度对照法----同板---大致同位、同大、同色泽4．定量方法（1）目视比色法-----半定量法（精度±10%）（2）斑点洗脱法（3）薄层扫描法(正在减少使用)

4．定量方法（1）目视比色法-----半定量法（精度±10第4节纸色谱分离技术一、分离原理(液-液萃取)利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，……，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现分离.二、仪器与材料

1．色谱滤纸想一想:色谱滤纸如何选择?第4节纸色谱分离技术一、分离原理(液-液萃取)二、仪器2．展开剂（1）纸色谱固定相一般是什么?（2）纸色谱展开剂如何选择?3．展开容器圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭下行纸色谱展开缸2．展开剂（1）纸色谱固定相一般是什么?（2）纸色谱展开剂如三、操作技术1．色谱滤纸的准备（1）用于下行法的色谱滤纸（2）用于上行法的色谱滤纸2．点样样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后