微藻大规模培养技术的研究

微藻大规模培养技术的研究

微藻是一个重要的能源微生物，是从经济效率和生殖源中分离出来的重要因素。随着人类社会资源短缺的压力和环境问题日益突出,利用微藻油脂转化生产生物柴油及其它相关代谢产品,部分替代化石能源,是可持续发展的必然要求。筛选优良产油藻种用来工业化大规模培养是微藻生物柴油的首先需要解决的难题。筛选出最佳的产生物柴油微藻的工作也成为目前研究工作的热点。1978年到1996年美国能源部开展了“水生物种计划”(TheAquaticSpeciesProgram),在20年的时间内从3000株藻种中选出了大约300株的高效产生物柴油藻种。1990年到2000年,日本国际贸易和工业部资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目,耗资近3亿美元,分离出1万多株微藻。但是,能够工业化产生物柴油的藻种极少,微藻生物柴油的研发和产业化进程都受其制约。微藻种类丰富,广泛分布于淡水和海水中,全球已经鉴定的微藻大约有40000种,而且其数量还在不断增加。目前,产油藻种的筛选评价工作局限性较强,主要参考生长速率、含油率、油脂组成等显著指标。实际上,产油微藻藻种如果按照整个微藻生物柴油的生产系统来看,需要综合考虑的因素很多。在美国能源部2009主持制定的“NationalAlgalBiofuelsTechnologyRoadmap”中,微藻生物柴油技术的系统集成及其技术经济分析被列为一个非常重要的部分。微藻生物柴油技术涵盖多个环节,是一个复杂的系统工程,包括微藻的筛选和培育,获得性状优良的高含油量藻种,光生物反应器中吸收光能和CO2等,生成微藻生物质,最后经过采收、加工,转化为微藻生物柴油。目前,研究常集中在某个或某几个环节的优化,微藻生物柴油制备结果不但取决于各个环节的效率,更重要是取决于系统内各个环节的的相互作用和耦合。微藻藻种筛选需要考虑整个技术工艺,微藻评价各项指标之间相互交错,边界模糊不清,综合考虑时的重要性又不相同。若仅从单个指标或少数几个指标分析评价难以得出有效结果,藻种筛选也成为了微藻生物柴油的重要瓶颈。在传统的藻种筛选中,筛选的评价指标简单而且相对独立。选择一种合适的数学评价方法对产生物柴油微藻的各项性能进行综合分析是非常必要的。目前,李林蔚等从10株发酵性能差异较大的酵母中利用模糊综合评价筛选出了2株适于超高浓酿造的酵母菌种。陈丹花等将模糊综合评价应用于啤酒酿造的小麦品种的筛选,并取得2株适应啤酒酿造的小麦。目前尚未见能有效整合众多微藻评价质指标并能有效评价的方法,而以模糊数学为基础的模糊综合评价法,综合考虑产生物柴油微藻的多项指标对三株产油微藻进行模糊综合评价。利用模糊综合评价进行藻种评价为藻种选筛选提供了一个全新的方法,更为藻种筛选工作奠定一个基础。1材料和方法1.1典型培养物保藏中心小球藻LICME001(ChlorellavulgarisLICME001,中国典型培养物保藏中心编号:CCTCCNO.:M209256)微绿球藻LICME002(NannochloropsisoculataLICME002)葡萄藻LICME003(BotryococcusBrauniiLICME003)本实验室保藏。1.2方法1.2.1改良f/2培养基用1000ml三角烧瓶培养,温度27℃,光/暗循环16∶8,光强5000lux,接种量10%,接种藻密度5×106左右,培养周期15d,培养基为改良f/2培养基。1.2.2计算权重集,进行二级模糊综合评价模糊综合评价(fuzzycomprehensiveevaluation)是以模糊数学为基础,应用模糊关系合成的原理,将一些边界不清,不易定量的因素定量化,进行综合评价的一种方法。模糊综合评价法的基本原理:它首先确定被评价对象的因素(指标)集U=[r1r2…rn]和评价集V=[v1v2…vn]。其中ri为单项指标,vi为ri的评价层次。再分别确定各个因素的权重及它们的隶属度向量,获得模糊评价矩阵。最后把模糊评价矩阵与因素的权重集进行模糊运算并进行归一化,得到模糊评价综合结果。实际应用中,因素较多、权重分配清晰,采用二级模糊综合评价评价效果更为准确、清晰。二级综合评价的步骤如下:(1)将因素集U中的因素,按某原则将因素分为若干个一级子集块=[Ui1Ui2…Uik],且Ui=1,Ui∩Uj=ϕ(i≠j)Ui=1,Ui∩Uj=ϕ(i≠j)。其中Ui1Ui2…Uik,是对一个子集块Ui按某个性进行的二级划分。(2)对每一个Ui按一级综合评价法进行模糊综合评价。设评价集为V=[v12…vm],权重向量为Ai=[ai1ai2…aim],若对Ui的ni个因素进行综合评价后得到的单因素评价矩阵为Ri。(3)对代表的事物的综合评价为Bi=Ai。Ri=[bi1bi2…bim]。1.2.3光生物反应器中藻种的筛选李元广等从微藻生物柴油产业化技术开发角度提出抗生物污染能力、生长快、胞内油含量,适应气候能力为评价指标。夏金兰等认为生物能源原料微藻在高生物量和油脂含量的基础上,还需要适应pH,温度,盐度,光照强度等诸多因素影响。林喆等认为微藻及其培养液的特征(即藻种特性)对于采收的方法和效率有很大影响。Chiu等考察了Nannochloropsisoculata耐受不同浓度的CO2的生长和油脂含量,说明CO2的通入对藻体生长和油脂积累有很大的影响。Chang等用CO2固定效率为指标筛选出了高效固定CO2的优质藻种。Barbosa等也提及光生物反应器中剪切力对微藻生长有极大的影响。Richmond在其书籍中也提及色素含量、光合作用速率、藻种在不同培养条件(pH、温度、光强、渗透压等)的生长性状等都是藻种性质的一种表征。进一步通过对微藻生产企业的实际调研,实际生产中还包括分散性、粘壁性、抗菌利能力、水循环利用能力、藻渣利用能力等非常有意义参考指标。美国能源部2009年公布的“CultivatingCleanEnergy:ThePromiseofAlgaeBiofuels”指出微藻生物柴油的系统单元应该包括:培养、采收、提油、转换,只有最佳的产生物柴油微藻藻种评价体系应该需要涵盖整个过程,符合整个过程的要求,才能筛选出符合整个系统集成优化的产生物柴油微藻藻种。在美国的能源部09年提出的“Algae-to-BiofuelProductionPathways”基础上,制定了产生物柴油微藻藻种评价指标并根据微藻生物柴油开发的各个环节的要求,将评价指标分为三组:产生物柴油微藻的生理、生化指标:[生长速率,含油率,色素含量,油脂组成];产生物柴油微藻的培养工艺指标:[CO2耐受性,pH适应性,分散性,粘壁性,盐度适应性,抗菌能力,温度适应性,光强适应性,抗剪切力能力];产生物柴油微藻的后处理指标:[转化生物柴油品质,采收性能,破壁性能,藻渣利用效率,水资源循环利用](表1)。2结果2.1产生物柴油微藻的二级指标的评价产生物柴油微藻的藻种评价指标较多、层次分布清晰,因此,宜采用二级模糊综合评价。将二级模糊综合评价应用于产生物柴油微藻藻种评价,既能够通过单级模糊综合评价对评价指标体系中的定性指标的等级(优、良、中、较差、差)进行定量化的评价,又能够通过二级模糊综合对不同层次、多种类指标进行综合评价,能有效地适用于不同产生物柴油微藻的评价,从而确定产生物柴油微藻的最佳藻株。通过大量的实验测定和分析,得到各参试品种品质性状原始数据。原始数据经标准化处理,并交由多方专家分析、评估,对产生物柴油微藻的不同指标,按等级(优、良、中、较差、差)进行定量化的评价。再根据各藻种性状的重要性大小、育种目标,给出不同性状的权重系数。得到小球藻LICME001、微绿球藻LICME002和葡萄藻LICME003藻种品质评价表(表2、表3和表4)。产生物柴油微藻的二级指标的评价:由表1可以得到产生物柴油小球藻二级指标的模糊矩阵,有产生物柴油微藻的生理、生化指标R1,产生物柴油微藻的培养条件指标R2,产生物柴油微藻的后处理指标R3。其对应权重分别为W1,W2,W3。应用M(∧,∨)合成算子所求出的第二级模糊综合评价结果如下:B1=w1。R1=[0.4290.3570.0710.0710.071];B2=w2。R2=[0.4620.3080.1540.0770.000];B3=w3。R3=[0.4290.2860.2140.0710.000];同理,由表2可以得到产生物柴油小球藻二级指标的模糊矩阵,有产生物柴油微藻的生理、生化指标R1,产生物柴油微藻的培养条件指标R2,产生物柴油微藻的后处理指标R3。其对应权重分别为w1,w2,w3。应用M(∧,∨)合成算子所求出的第二级模糊综合评价结果如下:微绿球藻的第二级模糊综合评价结果如下:C1=w1。R1=[0.2670.4000.2670.0660.000];C2=w2。R2=[0.3130.3750.2500.0630.000];C3=w3。R3=[0.2350.3530.2350.1180.059];葡萄藻的第二级模糊综合评价结果如下:D1=w1。r1=[0.3750.3750.2500.0000.000];D2=w2。r2=[0.3070.4620.1540.0770.000];D3=w3。r3=[0.2670.4000.2670.0660.000];(2)产生物柴油微藻的一级指标的评价:第一级因素集U=[B1B2B3],令总单因素评价矩阵为u1=⎡⎣⎢B1B2B3⎤⎦⎥=⎡⎣⎢0.5000.2500.0830.0830.0830.4620.3080.1540.0770.0000.5000.2500.1670.0830.000⎤⎦⎥u1=[B1B2B3]=[0.5000.2500.0830.0830.0830.4620.3080.1540.0770.0000.5000.2500.1670.0830.000]依据专家评定的权重系数集(x)为:x=[0.350.400.25]做第一级模糊综合评价,得A1=u1。x=[0.3600.3150.1920.0690.064]同理,微绿球藻做第一级模糊综合评价,A2=u1。x=[0.2770.3310.2360.1040.052]同理,葡萄藻做第一级模糊综合评价,A3=u3。x=[0.3250.3710.2320.0710.060](3)产生物柴油微藻模糊综合评价结果:小球藻LICME001模糊综合评价集A1=u1。x=[0.3600.3150.1920.0690.064]由评价结果可知,该株微藻的藻种评价为优的隶属度为0.360,对良的隶属度为0.315,对中的隶属度为0.192,对较差的隶属度为0.069,对差的隶属度为0.064。根据模糊数学中最大隶属度原则,由评价集A1=[0.3600.3150.1920.0690.064]可得出的结论是:小球藻LICME001藻种品质为优,因为0.360最大,其对应的评价是“优”。同理,根据模糊数学中最大隶属度原则,由微绿球藻LICME002的评价集A2和A3可得出结论:微绿球藻LICME001藻种品质为良,因为0.331最大,其对应的评价是“良”。葡萄藻LICME003藻种品质为良,因为0.371最大,其对应的评价是“良”。3小球藻生物柴油的二级模糊综合评价通过该藻种评价,应用模糊综合评价能够有效的反应微藻的藻种品质,该方法可作为藻种筛选的评价方法。根据模糊数学原理,藻种模糊综合评价集能直观、准确的反映藻种的优劣。藻种的模糊概率越大,其品种的综合性状表现就越优,反之越劣。通过三株产油微藻的模糊综合评价,得到这三株藻种的模糊综合评价集分别为A1、A2和A3。根据最大隶属度原则,小球藻LICME001的品质为优等级别的产生物柴油藻种符,绿球藻LICME002和葡萄藻LICME003品质属于良等级别的产生物柴油微藻。通过整个评价过程分析,小球藻LICME001在产生物柴油微藻的生理、生化指标,培养工艺指标,后处理指标,这三个模糊综合评价中为优级品质。通过微藻生物柴油生产的技术工艺的各个参数指标的比较,微绿球藻、葡萄藻的培养工艺和后处理工艺相对较差,目前还无法胜任整个培养工艺的技术要求。美国的绿色燃料公司和“微型曼哈顿计划”中都有采用小球藻作为工业藻种。小球藻LICME001、绿球藻LICME002和葡萄藻LICME003的二级模糊综合评价过程能够有效的解析了三种藻的生理、生化指标,培养工艺指标,后处理指标。该评价为产生物柴油微藻的选种、后续培养优化和藻种优化提供了指导。目前,微藻藻种筛选多采用少数指标进行分析,藻种评价指标的选取和评价策略相对简单。Fujii等从15种自然藻类样品中选育出1株新型绿藻GK12,是以生物量、虾青素含量等作为评价指标。宋玉凤等从北海螺旋藻养殖场水中分离出9株藻种以生物量,培养液颜色和液体分布作为指标。通过部分指标进行直接评价能够说明该藻种一些优良性状,但从系统工程的角度来看,传统的评价方法不能将整个藻种在工艺中的属性给诠释透彻,作为藻种评价来说局限性较强。常规的产生物柴油微藻藻种评价方法多以油脂含量高,生长速率等指标分析,则葡萄藻LICME003属于优级藻种。但从整个微藻生物柴油的技术工艺来看,其在培养工艺和后处理工艺上存在不足,限制了利用葡萄藻炼制生物柴油的技术工艺,葡萄藻LICME003并不是优级的藻种。通过模糊综合评价的方法能有全面、