高效液相色谱-串联质谱法检测贝类中原多甲藻酸

高效液相色谱-串联质谱法检测贝类中原多甲藻酸

甲氧酸ala清朝的原始海藻是20世纪90年代在欧洲发现的一种新的甲基卤单胞菌素。它由前多甲基藻类（如图1所示）生产，具有独特的6、5、6-3和环胺结构（如图1所示）。人食用含有AZA的贝类后会出现恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等症状,与腹泻性贝毒素(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)中毒症状非常相似;而AZA的作用时间更久,中毒后的恢复期更长,是一类比DSP危害更大的毒素。2004年,由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳软体生物毒素工作组将AZA毒素归为8大类贝类毒素之一,欧盟立法机构确立双壳软体动物中AZA(AZA1~AZA3)的最大检出限(LOD)是160μg/kg(以贝肉计)。在我国的某些海域已发现有多种原多甲藻的分布;世界贸易的频繁交流也导致有毒原多甲藻随船舶压舱水进入我国的可能性大大增加,具有污染我国贝类产品的潜在威胁。因此,建立AZA贝类毒素的检测方法并对AZA进行监控,对提高我国水产品安全水平、保护消费者健康具有积极意义。目前AZA常用的测定方法有小鼠口服测试法和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析法。其中,小鼠口服测试法只能测定毒素总量,且受试小鼠的中毒症状与DSP的中毒症状相似,容易出现假阳性结果而导致无法对其准确定性定量。随着LC-MS联用技术的不断完善和其在毒素分析领域的广泛应用,人们开始重点研究建立LC-MS分析AZA的方法,并对其分布进行调查研究[9,10,11,12,13,14,15,16]。本文针对AZA中毒性最强、分布范围最广的AZA1,采用液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)技术,建立了贝类中AZA1的检测方法,并用于实际贝类产品的分析。1实验部分1.1实验仪器和材料ThermoFinniganTSQQuantumAccess液相色谱-高分辨串联三级四极杆质谱联用仪;CR22G型高速离心机(日本日立公司);TalboysVX-3000型漩涡混合器(美国Troemner公司);KQ-600DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司);T18Basic型均质机(德国IKA公司);OasisMAX阴离子交换固相萃取(SPE)柱(3mL,60mg)(美国Waters公司)。AZA1标准品购自于加拿大海洋生物科学研究所。甲醇、乙酸乙酯(色谱纯,德国Merk公司),乙腈(色谱纯,德国CNW公司),丙酮(色谱纯,美国J.T.Baker公司),甲酸、甲酸铵(色谱纯,德国Fluka公司),实验用水均来自Milli-Q超纯水系统。贝类样品主要是菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、紫贻贝(Mytilusedulis)、栉孔扇贝(Chlamysfarreri)、长牡蛎(Crassostreagigas)、栉江珧(Atrinapectinate),2009年1~7月购于大连、青岛、广州水产品市场,每月中旬采样1次,立即低温运回实验室后-20℃冷冻保存待用。1.2hplc-ms-ms分析条件1.2.1流动相a/b色谱柱:AtlantisdC18(150mm×4.6mm,5.0μm);柱温:35℃;样品室温度4℃;进样量:5μL;流动相分为A、B两部分,其中A为乙腈-水(95/5,v/v),B为水,两者均含有50mmol/L甲酸和2mmol/L甲酸铵溶液,采用等度洗脱方式,A/B=80/20(v/v);流速:200μL/min。1.2.2数据分析和结果离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子(ESI+)扫描;检测方式为选择反应监测(SRM)模式;电喷雾电压:4000V;毛细管温度:350℃;辅助气压力:172.4kPa;鞘气压力:68.95kPa。扫描宽度(m/z):0.01;扫描时间:0.5s。母离子(m/z):842.5;子离子(m/z):824.5、672.4、654.4;定量离子(m/z):824.5;3种子离子对应的碰撞能分别为32、43、49eV。1.3萃取阴离子spe柱、粗液提取样品提取取贝类组织100g,以10000r/min均质5min。准确称取均质后的样品5.00g于50mL离心管中,加入10mL80%甲醇-水溶液,旋涡振荡1min,超声提取10min,以7000r/min离心5min。将上清液转移至25mL容量瓶中。重复上述操作,合并上清液,用80%甲醇-水溶液定容至25mL。混匀后准确量取5mL于10mL玻璃管中,40℃氮气吹至体积少于1mL,加入2mL乙酸乙酯后旋涡1min进行萃取,以3000r/min离心5min。重复上述操作,合并乙酸乙酯层后40℃氮气吹干,加1mL80%甲醇-水溶液溶解,待富集净化。富集净化MAX阴离子SPE柱依次用甲醇、5%氨水各3mL进行预处理,然后加入提取液,依次用5%氨水1mL、5%甲醇-水溶液2mL淋洗,最后用1mL甲酸-甲醇(2∶98,v/v)洗脱。洗脱液于40℃下氮气吹干,准确加入200μL乙腈定容,旋涡1min后过0.22μm有机滤膜,滤液供LC-MS/MS分析。1.4方法学的检验通过标准品添加回收率试验进行方法学验证,包括线性范围、回收率、精密度、检出限和定量限。2结果与讨论2.1质谱扫描结果首先对AZA1标准溶液(质量浓度为2.4μg/L)在正离子模式下进行全扫描及二级质谱扫描,得到二级质谱图。其分子断裂机理是,AZA1的C20与C21位上的羟基脱去1分子水,之后脱去A环,断裂模式为:[M+H]+→[M+H-H2O]+→[M+H-H2O-C9H10O2R1R3]+,即842.5→824.5→672.4。2.2层析条件的优化2.2.1色谱柱对az1的分离效果本实验比较了XTerraMSC18、AtlantisdC18与AtlantisHILICSilica等不同色谱柱对AZA1分离效果的差异。结果发现,AtlantisHILICSilica色谱柱对AZA1的保留强度高,不易洗脱,导致拖尾现象严重。XTerraMSC18与AtlantisdC18色谱柱的分离效果较好,但后者得到的谱峰更加尖锐。因此,本实验选用AtlantisdC18作为分析色谱柱。2.2.2色谱柱及乙腈-水溶液比例对分离效果的影响Lehane等研究表明,含有甲酸和甲酸铵的乙腈水溶液作为流动相,可提高离子化效率;添加一定量的三氟乙酸可以有效改善AZA1的色谱峰形,但三氟乙酸对离子化效率有显著抑制作用。本实验结果也表明流动相中是否含有三氟乙酸可导致同一浓度AZA1的离子丰度相差数十倍,在很大程度上影响了AZA1的检出限。因此,本实验选用含50mmol/L甲酸、2mmol/L甲酸铵的乙腈-水溶液作为流动相,且未添加三氟乙酸,以提高离子化效率,降低检出限。在质谱条件确定的前提下,以AtlantisdC18色谱柱为分析柱,含有50mmol/L甲酸和2mmol/L甲酸铵的乙腈-水为流动相,比较了60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10等不同比例的乙腈-水溶液对峰形和保留时间的影响(如图2所示)。结果发现,有机相的比例对保留时间及峰宽有很大影响。当乙腈比例小于75%时,有前延峰,峰宽大于1min,保留时间大于5min;而当乙腈比例大于85%时则导致保留时间过短,无法与样品基质完全分离,从而影响目标物的分离。比较而言,乙腈比例为80%时分离效果和保留时间均达到最佳。因此,本实验最终确定以含有50mmol/L甲酸和2mmol/L甲酸铵的乙腈-水(80∶20,v/v)为流动相,进行等度洗脱。2.3处理前的条件的优化2.3.1az1的提取由于贝类含有丰富的蛋白质、脂类及色素,在提取AZA1的过程中,部分杂质同时提取出来,所以选择合适的提取试剂对于保证AZA1的回收率和检出限具有重要意义。通过参阅有关文献方法,选用了3种不同的提取试剂,分别是甲醇、丙酮和80%的甲醇水溶液。结果发现:丙酮和甲醇具有较强的提取AZA1的能力,但得到的提取液含大量杂质,对随后的富集净化带来挑战,且严重影响目标物离子碎片丰度。由于AZA1为脂溶性毒素,因此我们尝试采用Vale等提取脂溶性毒素DSP的方法,应用80%甲醇-水溶液进行提取。结果表明,运用80%甲醇进行二次提取可将AZA1提取出来,回收率可达到90%以上,且提取液中含有的杂质较少,有利于进一步的提纯。因此,实验以80%甲醇-水溶液作为提取试剂。2.3.2up-4利用4.2.2判断spe柱的萃取净化SPE是样品富集净化过程中的关键,本实验比较了不同种类SPE柱的富集净化效果。已有报道表明,C18SPE柱对贝类样品中AZA具有较好的富集效果。因此,我们首先选择并比较了SupelcleanENVI-18(Supelco)、Sep-PakC18(Waters)、SupelcleanLC18(Supelco)等几种不同型号C18的提纯效果。结果表明,上述几种SPE柱均具有较高的回收率,但是采用纯甲醇对AZA1进行洗脱时,色素也同时被洗脱下来。因此,C18SPE柱对贝类中AZA1的净化不能达到完美效果。鉴于AZA1的分子结构中带一个羧基而呈现酸性,参考Gerssen等建立的多种脂溶性毒素的SPE方法,利用MAX阴离子交换SPE柱进行富集净化。实验采用两种活化方法:第一种是分别用3mL甲醇和3mL水活化,第二种是用3mL甲醇和3mL5%氨水活化。结果表明,甲醇和水活化后的MAX柱无法有效吸附AZA1,而经甲醇和氨水活化后,AZA1可被MAX柱完全吸附。原因是第一种方法中分别经甲醇和水活化后的MAX柱呈中性,提取液中的AZA1分子在通过MAX柱时不能完全以离子状态存在,未被完全吸附;而在第二种方法中由于5%氨水溶液的pH大于AZA1的等电点两个单位以上,所以AZA1在通过MAX柱时以阴离子状态存在而被MAX柱上的功能基团吸附。淋洗和洗脱过程采用不同浓度的氨水和甲酸溶液,以调整MAX萃取柱上的AZA1的存在状态,在有效去除杂质的同时保证了回收率。通过AZA1标准溶液过MAX柱试验表明,回收率大于95%。本实验中选取MAX柱提纯净化,能有效去除粗提液中色素等杂质,有利于降低方法的检出限,延长色谱柱的使用寿命。2.3.3降低检出限实验比较了甲醇、乙腈两种定容试剂对实验结果的影响。研究发现,选用乙腈作为定容试剂更有利于降低检出限。这是因为甲醇的溶解能力强,在溶解目标物AZA1的同时也溶解了其他的脂质;采用乙腈定容可以去除部分脂质的影响。此外,流动相中乙腈比例占80%,乙腈定容能避免样品在流动相中产生扩散效应,可有效改善色谱峰形。2.4方法学的检验2.4.1基质匹配标准曲线的绘制选用不含AZA1的空白扇贝闭壳肌样品,按1.3节方法制备空白基质液,并分别添加AZA1标准溶液,配制质量浓度范围为48.85~2442ng/L之间的基质标准液。根据AZA1定量离子5次测得的平均峰面积与相应浓度进行线性回归,绘制基质匹配标准曲线。结果显示,线性关系良好,相关系数R2=0.9981。2.4.2方法、检测限和检出限选用不含AZA1的空白扇贝闭壳肌样品,分别添加36.64、73.27、146.54pg/g3个含量水平的AZA1标准溶液,按建立的方法处理样品,分别测定并计算回收率和精密度,测得平均回收率为75.8%~82.5%,相对标准偏差(RSD)为6.5%~10.0%。标准溶液、空白样品、加标样品及阳性样品色谱图分别见图3a~d。该方法在测定标准添加回收率时的最低添加量为36.64pg/g,此时AZA1的信噪比(S/N)大于10,并且具有较好的回收率,故确定AZA1的定量限为36.64pg/g。以3倍S/N计算方法的检出限,确定该方法的检出限为11.00pg/g。不同加标浓度AZA1的回收率、精密度见表1。Lehane等分别针对5种和10种AZA建立的LC-MS/MS分析方法中,AZA1的检出限均相当于400pg/g,与本方法检出限相差很大。可能原因有以下几点:首先是Lehane等采用丙酮提取,导致提取液中杂质过多,且色素未被完全去除,降低了灵敏度;其次是Lehane等针对每一种AZA分子离子进行多次断裂,也影响了离子丰度;最重要的原因可能是Lehane等所建立的方法中采用三氟乙酸作为流动相组分,虽然一定程度上改善了峰形,降低了杂质离子峰的强度,但同时也大大降低了目标物的离子强度。2.5阳性样品的检出情况利用该方法分析了2009年1~7月采自大连、青