不同生长时期微藻的动态积累过程

不同生长时期微藻的动态积累过程

0微藻生物柴油的生产随着世界经济的快速发展，石油、天然气、天然气等化石能源的消耗显著增加。另一方面，石化能源正在恶化。另一方面，大量二氧化碳气体进入宇宙，导致温室效应。自《京都议定书》签署生效后,二氧化碳在全球范围内受到排放限制,如何减排二氧化碳并对其进行资源化利用也成为研究热点。近年来生物柴油作为化石能源的替代燃料,已成为国际上发展最快、应用最广的环保可再生能源。生物柴油是指来自生物体的油脂(主要为甘油三酯)与醇类经转酯作用而形成的单烷基脂肪酸酯。欧美等国家耕地资源丰富,主要以油菜和大豆等植物油脂为原料;巴西主要利用蓖麻籽油进行生物柴油生产;日本利用煎炸废油及牛油脂为原料生产生物柴油;东南亚国家种植油棕,获取油脂资源。我国人口众多,耕地资源匮乏,以油料作物为原料制备生物柴油不符合中国国情。我国的木本油料植物资源丰富,因此我国目前主要以木本油料植物为原料生产生物柴油,如麻疯树(Jatrophacurcas)、黄连木(Pistaciachinensis)、光皮树(Cornuswilsoniana)等。但是这些木本油料植物的果实一般一年只收获一次,以此为原料制备生物柴油受到季节的限制。微藻光合作用效率高,生长周期短、速度快。而且,微藻大多分布在江海湖泊中,不与农作物争地,可以整年生长。目前的产油藻主要是葡萄藻(Botryococcusbraunii)、小球藻(Chlorellapyrenoidosa)等。因此,微藻作为新型生物柴油原料,是未来生物柴油发展的研究热点。微藻制备生物柴油存在两个关键问题:一个是建立快速高效的产油藻筛选方法;一个是研究产油藻油脂积累的规律和机理,使收集时既满足产油藻的高油脂含量,又满足其高密度、高速率生长。为此我们利用尼罗红染色法对微藻进行筛选,并利用该方法对微藻中性脂的积累过程进行了跟踪,结合透射电镜观察脂肪体,使中性脂的积累过程更加形象、直观。尼罗红是一种具较强荧光特性的染料,它具有较强的疏水性,依溶剂疏水程度不同而呈现从金黄色到红色不同的荧光颜色,但在水溶剂中,它的荧光完全淬灭。另外,尼罗红具有光化学稳定性,它特有的激发光波长范围可以排除一些生物分子对测定的干扰。研究表明,尼罗红染色后细胞荧光强度与细胞内油脂含量显著相关[9~15]。过去通常采用重量法和各类色谱法测定植物中的脂类含量[16~18]。这些方法不仅需要的生物样品量大,而且需要一个较长的提取过程。尼罗红染色法可以不经抽提,直接测定藻类细胞的中性脂含量,而且所需生物样品量小,使分析测定方法明显简化。1材料和方法1.1材料表面1.1.1板中培养板的培养63株海洋微藻取自宁波大学微藻种质库,使用NML3#培养液于24孔板中培养。每个孔加入1.5ml藻液和1mlNML3#培养液,温度20℃,盐度25~30‰,光照强度50μmol/(m2·s),光暗比12h∶12h,培养24h,活化藻种,使其均处于指数生长期。1.1.2荧光显微镜、透射电子显微镜CASY快速细胞活力分析仪(CASYModelTT,Germany),酶标仪(ThermoScientificVarioskanFlash),荧光显微镜(OlympusBX-60),透射电子显微镜(日立H-7650)。尼罗红染液(0.5mg/mL)购于上海杰美基因医药科技有限公司,于-20℃保存,避免光照。1.2方法1.2.1藻细胞荧光强度检测藻种活化后,取96孔荧光板,每孔加入240μl活化藻液,1μl尼罗红染液,振荡混匀,30℃染色10min后,使用酶标仪检测530nm光激发下,580nm处的荧光强度,再扣除未染色藻液在该波长处的荧光强度。每个样品设3个重复。然后使用CASY快速细胞活力分析仪分别测定240μl藻液中藻细胞的总体积。每个样品重复测定3次。以微藻单位体积内的荧光强度表征微藻单位体积内的中性脂含量。1.2.2中性脂质体生物酶活性测定藻种筛选完成后,选取其中油脂含量较丰富的假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis),在1.1.1所述相同条件下于100ml三角瓶中进行培养,用于检测中性脂的动态积累过程。蛋白核小球藻和绿色巴夫藻的接种密度约为2×106cells/mL,假微型海链藻的接种密度约为3×105cells/mL。从接种第二天开始,每天测定三种微藻的荧光强度和细胞密度,荧光强度测定方法同1.2.1藻种筛选,细胞密度的测定采用血球计数板法。以微藻单个细胞内的荧光强度表征微藻单个细胞内的中性脂含量。1.2.3荧光显微镜观察取240μl的假微型海链藻藻液,加入1μl的尼罗红染液,混合均匀,取一滴于荧光显微镜下进行观察。另取假微型海链藻藻液,离心去上清,经固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、聚合、修块、定位、超薄切片和超薄切片染色后,使用透射电子显微镜观察不同生长时期假微型海链藻细胞内的脂肪体。2结果2.1小球藻荧光强度本实验对宁波大学63株海洋微藻进行了筛选,包括16株硅藻、16株绿藻、15株甲藻、12株金藻和4株黄藻(表1)。结果显示,单位体积内的荧光强度含量最高的为假微型海链藻,达到436.0,比常见的产油微藻———小球藻约高出1~3倍(被检测的3株小球藻(NMBluh015-1、NMBluh015-2、NMBluh015-3)单位体积内的荧光强度依次为257.0、117.6和122.0)。另外,不仅不同种微藻单位体积内的荧光强度高低不同,同一种微藻的不同品系也有差别,比如Heterosigmaakashiwo的三个品系NMBRah03-2、NMBRah03-2-2和NMBRah03-2-3。筛选结果中,脂类含量高的前20株微藻中,硅藻6株,绿藻和金藻分别5株,甲藻和黄藻分别2株。2.2绿色巴夫藻的生长和接种过程实验测定了假微型海链藻(T.pseudonama)、蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和绿色巴夫藻(P.viridis)三种海洋微藻的细胞密度和单个细胞内的荧光强度在培养过程中的变化。如图1所示,在培养的10d中,假微型海链藻单个细胞内的荧光强度先减弱,再稳定,第3d之后逐渐增强;第3d假微型海链藻的生长进入平台期。这表明假微型海链藻单个细胞内的中性脂在平台期开始大量积累。在第1~2d荧光强度减弱,可能是因为假微型海链藻指数生长期和平台期短暂,接种时已处于衰败期,单个细胞内的中性脂含量比较高。图2中,蛋白核小球藻单个细胞内的荧光强度在第1~3d增强,第3~7d比较稳定,第7d之后逐渐增强;蛋白核小球藻第1~3d处于指数生长前期,第3~7d处于指数生长中期,第7d后进入指数生长后期,最后到达平台期。实验表明蛋白核小球藻单个细胞内的中性脂在指数生长前期有所增加,之后趋于稳定,指数生长后期开始大量积累。图3中,绿色巴夫藻单个细胞内的荧光强度在前8d比较稳定,第8d之后逐渐增强;绿色巴夫藻第8d处于指数生长后期。表明绿色巴夫藻单个细胞内的中性脂在指数生长后期开始大量积累。2.3透射电镜观察假微型海链藻在自然条件下为链状分布,实验室培养后分散成单个细胞,经尼罗红染色后,其脂肪体在荧光显微镜下发出黄色荧光,如图4所示。由于假微型海链藻的个体很小,为了便于观察,我们采用透射电镜对脂肪体进行进一步的观察。如图5所示,A、B、C分别表示假微型海链藻在培养第2d、第5d、第8d时的透射电镜图,其中箭头指示的为脂肪体。培养到第2d时只有一个脂肪体,第5d时有5个,第8d有6个。随着培养时间的增加,脂肪体不仅数目增加,体积也变大。由图1可知,第2d假微型海链藻生长比较旺盛,第5d达到平台期末期,刚刚开始进入衰败期,第8d藻细胞已经衰败。培养到第8d时,从图5C中我们看到藻细胞有了一系列衰败迹象,细胞开始变形,片层结构开始解体。3种微藻中性脂的积累Alonzo和Mayzaud于1999年利用尼罗红染色法对浮游动物的中性脂和极性脂进行荧光定量,发现用特定生物的脂类制作的标准曲线中荧光强度和脂类的浓度呈线性关系,当用商业的脂类或者从其它生物获得的脂类作标准曲线时误差很大。因此,只有用特定生物的脂类制作的标准曲线,才能对特定生物不同生长时期的中性脂和极性脂进行绝对定量。所以,对于不同藻种的筛选无法制定统一的标准曲线,本实验得到的种质库藻种筛选结果只是对中性脂含量在不同微藻之间的相对筛选,对于其绝对含量需要通过重量法或者色谱法进行进一步测定。但是,尼罗红染色法操作简便,依然是一种很好的初级筛选方法。本研究筛选的结果表明,不仅不同种微藻的中性脂含量不同,同一种微藻不同品系的中性脂含量也有差别。硅藻、绿藻和金藻的中性脂含量比较高,含量最高的为假微型海链藻。尼罗红染色法不仅可以用于筛选产油藻,而且也是跟踪产油微藻的油脂积累过程的简便方法。由图1、图2和图3可知,三种海洋微藻单个细胞内的中性脂均在平台期或指数生长末期开始大量积累。这与魏东等对后棘藻(Ellipsoidionsp.)和眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)的研究结果一致。Emdadi等、Dunstan等也报道指出,中性脂(主要是三酰甘油)在平台期积累。虽然假微型海链藻的中性脂含量最高,但是其细胞密度在整个生长期都比较低。可能是培养条件没有达到假微型海链藻种群增殖的要求,如何提高假微型海链藻的细胞密度需要进行进一步研究。从本研究结果还发现,即使同种不同品系的微藻单位生物量中性脂含量差异也很大,说明微藻中性脂的积累与种类、培养条件及生长时期都密切相关。提高微藻油脂含量的另一条途径是通过基因工程方法对微藻进行遗传改造。美国再生能源国家实验室(NationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)于1991年开展了有关基因工程构建高油微藻的工作,并于1995年将乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因转化小环藻成功,这是一个重要突破。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A,是脂肪酸合成过程中的限速酶。二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油合成的最后一步反应的酶,也是三酰甘油合成途径的限速酶。这两种酶在微藻不同培养条件和不同生长时期的表达差异是否与中性脂的积累相关值得