付强-金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.5

金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立

答辩人付强专业生物化学与分子生物学指导老师崔亚丽教授

答辩日期2007-5-31西北大学硕士研究生论文答辩1

答辩内容

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背景介绍

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研究报告金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立

金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立

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全文总结

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致谢西北大学硕士研究生论文答辩2西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍乙型肝炎病毒概述•乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原体。

电镜下HBV颗粒的三种形态（摘自NEnglJMed2004,350:1118-29）HBV结构模拟图3西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍乙肝病毒表面抗原（HBsAg）4HBsAg种类大蛋白（LHBs）中蛋白（MHBs）主蛋白（SHBs）西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍5HBsAg的主要作用介导病毒进入宿主细胞诱导机体产生保护性抗体（HBsAb）早期诊断的血清学标志乙肝病毒表面抗原的常用免疫学检测方法比较

西北大学硕士研究生论文答辩方法

优点

缺点

双抗体夹心ELISA法

操作简便、快速，特异性高

灵敏度不够高，容易出现漏检胶体金免疫层析测定法

简便、快速，操作简单等优点，适用于急诊检验的需要灵敏度不如ELISA法，须与ELISA法并用

免疫荧光法

特异性强、敏感性高、速度快非特异性染色问题尚未完全解决，技术程序也比较复杂放射免疫分析法

灵敏度高达ng甚至pg水平，特异性强，精度高，可进行超微量分析存在放射性污染，不易保存，稳定性差背景介绍6西北大学硕士研究生论文答辩以磁性微粒为载体的磁分离酶联免疫技术（MAIA）背景介绍•磁性微粒的定义：磁性微粒(magneticparticles)，又称磁性微球(magneticbeads或magneticmicrospheres)，是由超顺磁性纳米粒子与高分子或其它无机材料复合形成的胶态颗粒。7金外壳磁内核GoldMagTM-AS微米金磁微粒磁分离酶联免疫法(magneticaffinityimmunoassay,MAIA)是20世纪80年代中期由瑞士Serono诊断中心发明的一种免疫检测新技术。

MAIA技术具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好、无放射性污染等优点，在医学检测、食品安全检测等领域有着很好的应用前景。西北大学硕士研究生论文答辩化学发光免疫技术背景介绍概念：集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。特点：

特异性高，敏感性高，操作简便、快速，试剂无毒，安全稳定，可自动化。目前，已有许多将化学发光免疫技术应用于临床检测的研究报道。如应用化学发光免疫分析法定量检测乙肝病毒标志物1，磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素2等；相关的检测仪器，如：ACCESS化学发光免疫分析仪(美国BeckmanCoulter公司)81.化学发光免疫分析定量检测乙肝病毒标志物方法学研究，标记免疫分析与临床，2004,(11)3:157~159.2.磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素的应用，国外医学临床生物化学与检验学分册，2005,(26)4:193~198.西北大学硕士研究生论文答辩以金磁微粒为载体的HBsAg免疫学检测方法原理图背景介绍9++化学发光金磁微粒—Anti-HBsHBsAgAg-Ab复合物HRP-Ab+Luminol,H2O2,PIPAg-Ab-酶复合物｛TMB底物检测吸光度与样品浓度成正比西北大学硕士研究生论文答辩研究目的及意义•研究目的以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进行验证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg的检测。

背景介绍•研究意义HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。10实验I西北大学硕士研究生论文答辩Ⅰ.以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原

HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被

包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择

温育时间的选择显色时间的选择精密度考察灵敏度考察特异性考察11实验I西北大学硕士研究生论文答辩HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被

包被前抗体溶液在280nm处具有明显的光吸收，包被反应完毕后剩余溶液在280nm处几乎没有光吸收出现，说明抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体几乎全部包被在金磁微粒表面。

HBsAb包被前后的紫外吸收曲线

12实验I西北大学硕士研究生论文答辩包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定

不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果注：P：阳性血清；N：阴性血清酶标抗体稀释度

501002003004001:600PN1.3310.0562.3210.0582.5730.0692.5820.0512.7690.0531:800PN1.140.052.1680.0582.3080.0542.5330.0522.3620.0531:1000PN0.8480.051.8390.052.0740.052.1750.052.2080.051:2000PN0.5610.051.1130.051.3300.051.4720.051.5060.511:3000PN0.2940.050.3710.050.5370.050.4780.050.4830.05抗体包被量（ng/孔）

当控制阳性对照OD值在2.0以上，阴性对照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被量为200ng/孔，酶标抗体1:1000稀释作为本实验的最佳条件。13实验I西北大学硕士研究生论文答辩温育时间的选择吸光度值随温育时间的变化

本实验中，选用温育时间为25min，此时抗原抗体反应已达平衡，且时间波动对吸光度值影响较小。

14实验I西北大学硕士研究生论文答辩显色时间的选择5min10min15min阳性对照2.6912.860OUT阴性对照0.0630.0870.113不同显色时间下的检测结果

本实验中，显色时间为15min时，非特异性的值较高，而显色10min和显色5min相比，阳性值和阴性值均变化不大，说明5min时，显色反应已达平衡。因此，选择5min作为最佳的显色时间。15实验I西北大学硕士研究生论文答辩临界值(Cut-off)的确定16吸光度值OD=0.105

阴性血样OD值分布平均值OD值：X=0.05根据常用的临界值判定标准来计算该方法的临界值，即为阴性对照平均值×2.1，阴性对照平均值<0.05时，阴性对照值以0.05计算，得Cut-off值为0.105，我们将OD=0.105作为本实验中判定阳性血样的临界值。实验I西北大学硕士研究生论文答辩金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性检测结果

次数检测结果(扣除空白值)阳性检测平均值(扣除空白值)RSD(%)(批内-)1P2.0582.2242.1702.1112.2132.1562.91N0.050.050.050.050.052P1.8502.1322.2172.2302.2192.1306.77N0.050.050.050.050.053P2.1372.1112.1902.1572.1492.1491.20N0.050.050.050.050.054P2.0912.1322.2302.1622.2042.1632.29N0.050.050.050.050.055P2.0452.0772.1712.1022.1502.1092.19N0.050.050.050.050.05RSD(%)(批间-)2.03

除一组检测外，方法的批内相对标准偏差（RSD）均小于5%，批间RSD仅为2.03%。另外，用该系统对HBsAg国家参考标准品也进行了精密度测定，检测10份样品的相对标准偏差（RSD）为8.3%，这符合HBsAg国家参考标准品的精密度要求（RSD应小于15%）。说明金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性较好。17实验I西北大学硕士研究生论文答辩灵敏度考察adr亚型阳性对照阴性对照0.2ng/mL0.5ng/mL1.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1430.1540.145adw亚型阳性对照阴性对照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1100.1770.300ay亚型阳性对照阴性对照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.0600.1080.184adr亚型阳性对照阴性对照0.2ng/ml0.5ng/ml1.0ng/mlOD（扣除空白）

OUT0.050.050.0910.187adw亚型阳性对照阴性对照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0370.0910.204ay亚型阳性对照阴性对照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0260.0740.146金磁微粒为载体HBsAg检测系统的灵敏度检测结果

商品化的ELISA试剂盒的灵敏度检测结果

注：OUT表示所测值超出仪器的检测范围

18实验I西北大学硕士研究生论文答辩特异性考察

用本系统检测HBsAg国家参考品的20份阴性血清及3份强阳性血清，结果显示，阴性符合率为100%(20/20)，阳性符合率为100%(3/3)。此外检测了203份献血者的血样，其结果与应用商品化试剂盒的结果一致。同时检测了81份HBsAg阴性献血者的血样，其阴性符合率为100%(81/81)。

19阳性参考品1.4392.552.708阴性参考品0.0640.0710.0540.0460.0590.0820.0600.0510.0520.0670.0550.0520.0690.0530.0530.0540.0670.0550.0450.071实验I西北大学硕士研究生论文答辩小结建立了以金磁微粒为载体，检测血清中HBsAg的方法。精密性试验表明，应用该法检测阳性血清及阴性血清时，方法的批内及批间相对标准偏差在1.20~7%的范围，符合临床检测要求。选用卫生部临床检验中心的HBsAg国家参考品对本系统进行灵敏度分析，结果显示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最低检出浓度分别为0.5ng/ml，0.5ng/ml及1.0ng/ml；符合HBsAg国家参考品灵敏度检测的标准，且与目前商品化ELISA试剂盒的检测水平相当。用该方法检测献血员血清