第九章聚合酶链反应及相关技术

第九章聚合酶链反应及相关技术第1页，课件共86页，创作于2023年2月聚合酶链反应于二十世纪80年代由K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。第2页，课件共86页，创作于2023年2月第一节聚合酶链反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第3页，课件共86页，创作于2023年2月第一节聚合酶链反应第4页，课件共86页，创作于2023年2月聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是DNA体外复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似第一节聚合酶链反应第5页，课件共86页，创作于2023年2月第一节聚合酶链反应一、PCR反应原理、反应过程和特点二、PCR的反应体系三、PCR的反应条件四、PCR技术的质量控制第6页，课件共86页，创作于2023年2月一、PCR反应原理和反应过程1.原理DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C～95C退火（annealing）:40C～70C

延伸（extension）:72C

第7页，课件共86页，创作于2023年2月变性:DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板退火:引物与模板互补结合，形成杂交链延伸:按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3´端，TaqDNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链一、PCR反应原理和反应过程第8页，课件共86页，创作于2023年2月5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入试管中添加反应混合液及样本变性一、PCR反应原理和反应过程第9页，课件共86页，创作于2023年2月5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环延伸继续延伸一、PCR反应原理和反应过程第10页，课件共86页，创作于2023年2月5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n个循环2n个拷贝一、PCR反应原理和反应过程第11页，课件共86页，创作于2023年2月2.特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增反应一、PCR反应原理和反应过程第12页，课件共86页，创作于2023年2月二、PCR的反应体系参与PCR反应的主要成份:1.模板2.引物3.脱氧核苷三磷酸4.TaqDNA聚合酶5.镁离子浓度6.其它反应因素第13页，课件共86页，创作于2023年2月1.模板（template）基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng

反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增二、PCR的反应体系第14页，课件共86页，创作于2023年2月2.引物(primer)化学合成的寡核苷酸与模板特异地结合决定产物的特异性和长度二、PCR的反应体系第15页，课件共86页，创作于2023年2月设计引物的原则(一)两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18～25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物浓度：0.1～0.2μmol/L，浓度过高容易生成引物二聚体二、PCR的反应体系第16页，课件共86页，创作于2023年2月设计引物的原则(二)引物的碱基组成应平衡，C+G碱基含量在引物中的比例一般以45%～55%为宜引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5´端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）二、PCR的反应体系第17页，课件共86页，创作于2023年2月3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加最适浓度：20～200μmol/L二、PCR的反应体系第18页，课件共86页，创作于2023年2月4.TaqDNA聚合酶

从一种生活在热泉（80℃～90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性二、PCR的反应体系第19页，课件共86页，创作于2023年2月Taq酶的作用:在模板指导下，以dNTP为原料，在引物3´-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3´,5´-磷酸二酯键，使DNA链沿5´→3´方向延伸，催化DNA合成最适酶量：1～2.5U二、PCR的反应体系第20页，课件共86页，创作于2023年2月TaqDNA聚合酶无3´→5´外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，因此扩增的片段越长，错配的机率越高二、PCR的反应体系第21页，课件共86页，创作于2023年2月耐热的高保真DNA多聚合酶：PwoDNApolymeraseTthDNApolymerasePfuDNApolymerase高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、PCR的反应体系第22页，课件共86页，创作于2023年2月5.镁离子浓度对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，影响酶的活性dNTP浓度为200μmol/L时，MgCl2浓度为1.5mmol/L较宜二、PCR的反应体系第23页，课件共86页，创作于2023年2月6.其它反应因素pH：反应所需的最适pH值在7.2左右盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20、DTT等二、PCR的反应体系第24页，课件共86页，创作于2023年2月三、PCR的反应条件

反应温度（变性、退火、延伸）2.反应时间（变性、退火、延伸）3.循环次数（PCR效率及产物量）4.PCR过程的实时监测第25页，课件共86页，创作于2023年2月1.反应温度

变性温度：94℃～97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右温度过高：降低扩增效率温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72℃三、PCR的反应条件

第26页，课件共86页，创作于2023年2月2.反应时间

第一次变性应给予足够时间每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增三、PCR的反应条件

第27页，课件共86页，创作于2023年2月3.循环次数

一般设为25～35个循环每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长三、PCR的反应条件

第28页，课件共86页，创作于2023年2月一个分子的模板经过30个循环，理论上即可得230(约109)个拷贝产物实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%左右三、PCR的反应条件

第29页，课件共86页，创作于2023年2月扩增反应的平台效应：PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25～35个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。三、PCR的反应条件

第30页，课件共86页，创作于2023年2月指数增长期线形增长期平台期循环数

理论值

实际值Log产物DNA4.PCR实时监测三、PCR的反应条件

第31页，课件共86页，创作于2023年2月平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早平台效应产生的因素：引物二聚体的产生反应体系各组分的消耗引物和已扩增的DNA片段间的竞争等三、PCR的反应条件

第32页，课件共86页，创作于2023年2月四、PCR技术的质量控制1.实验室的规范化设置试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区第33页，课件共86页，创作于2023年2月2.防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物每次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射四、PCR技术的质量控制第34页，课件共86页，创作于2023年2月3.PCR技术的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证分析前分析中分析后室内质量控制和室间质量评价四、PCR技术的质量控制第35页，课件共86页，创作于2023年2月第二节以PCR为基础的相关技术第36页，课件共86页，创作于2023年2月第二节以PCR为基础的相关技术一、逆转录PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR诱导定点突变五、连接酶链式反应六、随机扩增多态性DNA第37页，课件共86页，创作于2023年2月一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等第38页，课件共86页，创作于2023年2月逆转录合成cDNA所用的引物：以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物一、逆转录PCR（RT-PCR）第39页，课件共86页，创作于2023年2月一、逆转录PCR第40页，课件共86页，创作于2023年2月二、定量PCR(quantitativePCR)对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等第41页，课件共86页，创作于2023年2月荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR(real-timePCR)FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中的产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量二、定量PCR第42页，课件共86页，创作于2023年2月荧光信号的检测方法二、定量PCR1.DNA结合染料技术2.水解探针技术3.杂交探针技术4.分子信标技术第43页，课件共86页，创作于2023年2月1.DNA结合染料技术PCR反应体系中加入SYBRGreenI染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光PCR过程中，SYBRGreenI染料结合到新合成的双链DNA分子中，结合的荧光信号和DNA含量成正比二、定量PCR第44页，课件共86页，创作于2023年2月

二、定量PCR第45页，课件共86页，创作于2023年2月优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高二、定量PCR第46页，课件共86页，创作于2023年2月2.水解探针技术技术荧光素标记探针探针的5´端和3´端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q探针完整时R基团与Q基团分别位于探针的二端，Q基团抑制R基团使其不能发射荧光二、定量PCR第47页，课件共86页，创作于2023年2月荧光信号检测PCR过程中，TaqDNA聚合酶沿模板移动，其5´→3´外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核苷三磷酸，R基团与Q基团随之分离R基团不再受Q基团的抑制便发射荧光，R基团信号强弱的程度与PCR反应产物的拷贝数成正比二、定量PCR第48页，课件共86页，创作于2023年2月水解探针技术二、定量PCR第49页，课件共86页，创作于2023年2月二、定量PCR第50页，课件共86页，创作于2023年2月3.杂交探针技术（hybridizationprobe）反应体系需要2条探针探针A的3´端标以荧光素作为荧光染料供体；探针B的5´端标以另一种染料，作为荧光染料受体。2个探针的序列头尾排列，并且相距仅间隔1个碱基，从而能够进行荧光共振能量的转移二、定量PCR第51页，课件共86页，创作于2023年2月外来光源首先刺激供体荧光染料，供体便发光刺激附近的受体荧光染料，使后者再发射出具另一种波长的信号而被检测系统接收受体荧光染料在2个探针都与模板杂交时才会被激发而发射荧光信号二、定量PCR第52页，课件共86页，创作于2023年2月分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸环状区(15～30个核苷酸)柄区(5～8个碱基对)组成5´末端标记荧光基团3´末端标记淬灭基团4.分子信标技术（molecularbeacon）二、定量PCR第53页，课件共86页，创作于2023年2月在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两端的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而使荧光淬灭，荧光本底极低当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构型发生变化，柄部被打开，从而使荧光基团远离淬灭基团而发射荧光二、定量PCR第54页，课件共86页，创作于2023年2月分子信标技术原理R二、定量PCR第55页，课件共86页，创作于2023年2月定量PCR参照系统二、定量PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置第56页，课件共86页，创作于2023年2月1.外参照系统Ct值(cyclethreshold)扩增曲线与荧光本底基线的交叉点处相应的反应循环数,即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小二、定量PCR第57页，课件共86页，创作于2023年2月相同模板进行96次扩增的扩增曲线图二、定量PCR第58页，课件共86页，创作于2023年2月利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数二、定量PCR第59页，课件共86页，创作于2023年2月2.内参照系统内标准品:一段人为地引入了突变序列的靶基因片段内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增内标准品和靶基因的探针分别用2种不同的荧光染料标记，二者探针杂交的序列不同二、定量PCR第60页，课件共86页，创作于2023年2月同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率二、定量PCR第61页，课件共86页，创作于2023年2月三、多重PCR(multiplexPCR)

在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个靶片段第62页，课件共86页，创作于2023年2月四、PCR诱导定点突变1.引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物第63页，课件共86页，创作于2023年2月2.引入大片段缺失四、PCR诱导定点突变第64页，课件共86页，创作于2023年2月五、连接酶链反应(LCR）

空隙LCR引物与模板特异性互补引物A和B之间、a和b之间有一段空隙空隙在DNA聚合酶的作用下特异性延伸连接酶连接缺口第65页，课件共86页，创作于2023年2月六、随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是一种在整个基因组DNA内进行随机扩增而获得多态性长度DNA片段的技术用一条随机序列的引物与模板DNA序列作随机配对，反应过程中随机引物只有在与模板DNA互补后，在足够近的间距(200～2000bp)内、方向相对的两个引物片段之间的模板DNA序列才能被扩增第66页，课件共86页，创作于2023年2月六、随机扩增多态性DNA不同个体DNA序列之间存在差异或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体之间基因组DNA的结构等信息第67页，课件共86页，创作于2023年2月

随机扩增多态性DNA六、随机扩增多态性DNA第68页，课件共86页，创作于2023年2月RAPD的应用种群生物学研究基因组DNA图谱构建遗传鉴定临床致病菌的流行病学检测和分型DNA指纹鉴定六、随机扩增多态性DNA第69页，课件共86页，创作于2023年2月第三节PCR产物的检测第70页，课件共86页，创作于2023年2月第三节PCR产物的检测一、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）二、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）三、单链构象多态性（SSCP）四、变性梯度凝胶电泳（DGGE）五、融点曲线分析(meltingcurveanalysis)六、PCR产物的序列分析（sequencing）第71页，课件共86页，创作于2023年2月一、PCR-限制性片段长度多态性PCR-RFLP是对PCR产物作限制性片段长度多态性分析根据PCR产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物序列使扩增产物产生（或消失）酶切位点第72页，课件共86页，创作于2023年2月用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，PCR产物能（或不能）被酶水解而产生不同长度的片段根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段一、PCR-限制性片段长度多态性第73页，课件共86页，创作于2023年2月EcoRI水解

ABCABC一、PCR-限制性片段长度多态性第74页，课件共86页，创作于2023年2月二、等位基因特异性寡核苷酸用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交检测点突变的技术被检靶片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交第75页，课件共86页，创作于2023年2月PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点二、等位基因特异性寡核苷酸第76页，课件共86页，创作于2023年2月二、等位基因特异性寡核苷酸第77页，课件共8