液相色谱-串联质谱法测定人血浆中儿茶酚胺

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中儿茶酚胺

酚胺是一种重要的神经传导因素，包括类固醇、糊精素和氨基酸。作为神经传导的一个组成部分，它在调节不同的生理功能方面发挥着重要作用。测定儿茶酚胺的方法早已有报道,如液相色谱-电化学(HPLC-ECD),液相色谱-荧光检测方法(HPLC-FLD),液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS),但笔者未见国内HPLC-MS/MS的文献,本文建立一种用LC-MS/MS同时测定人血浆中3种儿茶酚胺类药物的方法。1型hplc仪1.1仪器与试药BrukerEsquire系列HCT离子阱质谱仪,配有ESI离子源(德国Bruker公司);1200型HPLC仪,包括MWD检测器、四元泵、在线真空脱气机、自动进样器(美国Agilent公司)。肾上腺素(epinephrine,E),去甲肾上腺素(noepinephrine,NE),多巴胺(dopamine,DA),Sigma公司产品。乙腈(德国Merck公司),甲酸、5-磺基水杨酸均为分析纯,水(法国Millipore超纯水系统)。2方法和结果2.1质谱条件色谱条件:流动相为V(乙腈)∶V(0.1%甲酸)=10∶90,流速为0.6mL/min,柱温为25℃,色谱柱为ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6×150mm,5μm),进样量,20μL。质谱条件:ESI(电喷雾离子源),正离子检测,雾化气(N2)压力设为30psi;干燥气(N2)的流速设为10L/min,干燥气(N2)的温度设为350℃。MRM方式检测,肾上腺素m/z184→166,去甲肾上腺素m/z170→152,多巴胺m/z154→137,裂解振幅电压分别设为0.35,0.35和0.30V。2.2混合储备液肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺,由0.1%HCl配制成10μg/mL的混合储备液于-20℃保存,使用时用Millipore超纯水稀释。2.3无氟抗凝血浆直接用磺基水杨酸去蛋白,每1mL血浆加50mg的5-磺基水杨酸混匀后,放置10min,4℃下10000转离心10min,取上清液,经0.45μm虑膜过滤直接进样20μL。2.4代血浆内源物的测定在选定的条件下,肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的保留时间分别约为2.4,2.2min和2.9min,代血浆中的内源物不干扰目标物的测定,见图1。2.5标准品溶液及前样检测取代血浆1mL置10mL离心管中,精密加入不同量的甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺标准品溶液,得浓度为0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,500.0ng/mL7个点。按照1.4方法处理后进样20μL检测。峰面积Y对浓度C进行线性回归,结果见表1。2.6肾上腺素和多肽标准品溶液取代血浆1mL置10mL离心管中,精密加入不同量的甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺标准品溶液,得浓度为10.0,50.0,400.0ng/mL低、中、高3个点。按照2.3方法处理,分别于当日和连续5d内测定,以测得的峰面积计算日内和日间RSD,结果见表2。2.7肾上腺素和多肽标准品溶液取代血浆1mL置10mL离心管中,精密加入不同量的甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺标准品溶液,得浓度为10.0,50.0,400.0ng/mL低、中、高3个点。按照2.3方法处理,平行操作5份,以测得的峰面积与相应的浓度标准溶液峰面积,计算回收率,结果见表2。3不同试剂对儿茶酚胺离子化效果的影响(1)本实验曾选用甲醇-0.2%甲酸,峰形不好;乙腈-0.2%甲酸为流动相,峰形有改善,但响应不佳;后用乙腈-0.1%甲酸溶液,响应明显增强,适当的甲酸有利于儿茶酚胺的离子化。(2)选用5-磺基水杨酸在作为去蛋白试剂,去蛋白效果好,而且操作简单方便,直接将5-磺基水杨酸固体粉末加入