一种链孢霉目黑霉科球孢枝孢吸附铀的特性研究

一种链孢霉目黑霉科球孢枝孢吸附铀的特性研究

土壤微生物、矿物、腐殖质和水分是土壤的重要组成要素，也是影响放射性核素在土壤中的迁移和转化的重要因素。土壤微生物不仅种类繁多、数量大、具有巨大的比表面积,而且本身是有活性的胶体,其表面含有多种活性官能团,这些官能团极易吸附重金属离子。微生物代谢过程还能促进重金属离子的氧化还原,而一些微生物甚至能富集某些重金属离子。然而目前考察核素在土壤中迁移影响因素,主要是以矿物质、腐殖酸等为对象,而考察微生物对核素迁移和转化的影响的报道还比较少,但这方面正在受到科学家的重视。此外微生物作为一种潜在的处理放射性废水的吸附剂,早已受到国内外研究者的广泛关注。目前已经发现多种与铀的富集作用有密切关系的微生物,包括细菌、放线菌、真菌和藻类,有些微生物对铀的吸附容量最高可达到615mg/g。由于微生物对元素的吸附作用有可能会阻滞放射性元素的迁移,本工作选择从拟作为低放射性废物处置场中分离的微生物,以此微生物活体为材料,考察它与铀相互作用规律。通过设置不同实验条件考察这些条件对微生物吸附低浓度铀的影响,在此基础上进行解吸实验,以及采用红外吸收光谱考察分析吸附作用机理。拟通过上述实验,以期了解该种微生物对铀的吸附行为,为进一步研究微生物对铀在土壤中的迁移和转化的影响提供实验数据。且微生物作为一种潜在的铀吸附剂,考察其对铀的吸附规律也具有一定价值。1实验部分1.1试剂、培养基硝酸铀酰[UO2(NO3)2·6H2O],分析纯,成都联合化工试剂研究院;偶氮胂Ⅲ(arsenazoⅢ),分析纯,北京化工厂;HCl、HNO3,分析纯,成都海兴化工试剂厂;EDTA(ethylenediaminetetraceticacid),化学纯,成都临江化工厂;柠檬酸(citricacid),分析纯,成都化学试剂厂。菌体培养基:用市售马铃薯自制马铃薯培养基PDA(200g马铃薯去皮切碎,适量水煮开30min后过滤得到土豆汁,加入20g葡萄糖或者蔗糖,固体培养加入琼脂15～20g,液体培养基不加琼脂,加水至1000mL,121℃灭菌16min)。HZQ-C恒温空气浴振荡器,哈尔滨市东明医疗仪器厂;TGL-16C离心机,上海安亭科学仪器厂;pHS-3C精密pH计,上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂;BS210S数显分析天平,感量0.0001g,德国Sartorius公司生产;721分光光度计,上海第三分析仪器厂;座式自动电热压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;无菌操作台,上海淀山湖净化设备厂。1.2菌种的活化纯化从拟作为中低放射性废物处理填埋场采集土壤并立即密封带回实验室。将一定量土壤放入灭菌锥形瓶,加适量无菌水,振荡20min后静置一段时间,取上层悬浊液用无菌水分别稀释到104、105、106倍后,各取200μL菌悬液接种于准备好的马铃薯培养基平板上。在恒温28℃培养5d,选取一种数量较多的菌落,从菌落上挑取适量菌体采用划线法接种于新的培养平板上,长出菌落后再次进行划线法纯化,直到得到单菌落。纯化后从长出的单菌落上挑取少量菌体接种于液体培养基扩大培养。培养5d后采用4000g离心收集菌体,经过蒸馏水洗涤3次后备用。为了鉴定菌种,首先对菌落和菌体进行观察,其次采用分子生物学的方法对其鉴定:十六烷基三甲基澳化铵(CTAB)法提取DNA,并采用26SrDNA通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增,扩增后进行测序,将测得的序列结果在NCBI数据库中进行同源性比对。1.3标准曲线的绘制铀的测量采用分光光度法,标准曲线的绘制方法:分别取0、1、2、3、4、5mL10mg/L的铀溶液于25mL的容量瓶中,分别加入pH=2.5的氯乙酸-乙酸钠缓冲液5mL,显色剂为1mL0.06%偶氮胂(Ⅲ),蒸馏水定容至25mL,参比液不加铀溶液,在λ=650nm处检测吸光值,绘制标准曲线,回归方程y=0.0086x-0.0028;系数r=0.9997。1.4铀的吸附及测定取一定量的硝酸铀酰储备液于锥形瓶中,根据不同条件调节pH值,称一定量新鲜菌体加入到溶液中,根据不同条件,在恒温振荡器振荡吸附一定时间后,离心取上清液,检测溶液中铀浓度。由于新鲜菌体附着较多的水分,称量时先将菌体置于滤纸上,用镊子轻轻挤压将水分排除。吸附率和吸附量通过检测吸附前后溶液中铀的浓度并计算得到,公式如下:吸附率R=(1-ρ/ρ0)×100%吸附量Q=(ρ0-ρ)V/m式中:ρ0为铀的初始质量浓度,mg/L;ρ为吸附过后的铀质量浓度,mg/L;V为加入的铀溶液总体积,L;m为加入的菌体质量,g。为了考察微生物对铀的最大吸附容量,进行了累计吸附实验,即用吸附后的菌体继续用来吸附铀,累计吸附量Qm等于每次吸附量相加值。1.5铀解吸率测量解吸实验采用在铀质量浓度为10mg/L溶液中吸附24h的菌体。在吸附实验后立即离心收集菌体,并将菌体加入到一定量解吸液中,解吸24h后测量解吸液中铀浓度,并计算解吸率(D)。解吸率计算公式:D=解吸液中的铀质量(mg)/吸附于菌体上的铀质量(mg)=ρ2V2/(ρ0V1R1)×100%式中:ρ0为吸附实验用铀溶液初始质量浓度,mg/L;V1为吸附实验用铀溶液体积,L;R1为吸附率;ρ2为解吸后溶液铀质量浓度,mg/L;V2为解吸液体积,L。1.6微生物的红外吸收光谱和原料催化剂同一批菌体,取0.5g不作处理作为对照,直接35℃下真空干燥箱中干燥,另取0.5g菌体加入到100mL初始质量浓度100mg/L的铀溶液中,pH=6,吸附24h后蒸馏水洗涤3次,放在滤纸上吸去过量水分后在35℃下真空烘干,对2份样品进行红外吸收光谱测量,原料硝酸铀酰则直接压片测量。2结果与讨论2.1srdna序列及同源性比对分析菌落及菌体显微照片示于图1,初步判断为一种真菌。通过CTAB法提取DNA,并采用真菌26SrDNA通用引物进行扩增,扩增后DNA电泳在500bp左右处出现条带,将扩增后的样品送基因测序公司测序,测得序列与NCBI数据库中进行同源性比对,得出该菌种26SrDNA序列与链孢霉目黑霉科球孢枝孢相似性为100%,故该菌体为链孢霉目黑霉科球孢枝孢属。2.2铀的上升和吸附接触时间对吸附铀的影响示于图2。接触初期t<4h时,对铀吸附非常快,吸附率迅速上升达到50%;在4h<t<24h时,菌体对铀的吸附减慢,吸附率达83%;在t>24h时,吸附率随时间延长极其缓慢的上升,可以认为吸附已经达到平衡。一般认为,菌体对铀的吸附分为2个过程:一是铀吸附于细胞壁表面,这个过程是相对较快的过程;二是随着铀在细胞壁上的逐渐吸附,吸附位点越来越少,吸附也就越来越慢,同时铀有可能缓慢进入细胞,该过程是不可逆过程,取决于微生物与铀的亲和性。以准二级动力学方程进行拟合:t/Q=1/(kads⋅Q2)+t/Qe式中:Qe、Q分别为吸附平衡及t时刻的吸附量,mg/g;t为吸附时间,min;kads为准二级吸附速率常数,g/(mg·min)。拟合结果示于图3,其中Qe=1.91mg/g,kads=0.0028g/(mg·min),r2=0.9991,说明吸附符合准二级动力学模型。2.3菌体的吸附能力pH对吸附铀有显著的影响,结果示于图4。由图4可以看出,pH≤2时菌体对铀几乎没有吸附效果;从pH=3至pH=5,吸附率随pH的升高而上升,并在pH=5～9之间菌体对铀保持较高的吸附率(90%以上)。不同pH下,吸附平衡时间不同(图5)。pH=4～9时,菌体的吸附平衡规律基本相同,约为24h,而在pH值为2和3时,吸附4h后基本不再吸附铀。以上现象可能与细胞壁上的官能团质子化有关,当pH值较低时,细胞上的官能团是质子化的;当pH值增大时,则有较多的H+从官能团上解离下来进入溶液,暴露出细胞壁上更多的带负电荷的基团,有利于金属离子与之结合而被吸附。因而随着pH值的升高菌体细胞壁官能团上的H+解离下来得越多,铀更容易被吸附在微生物上。2.4铀初始质量浓度的确定铀初始质量浓度变化对菌体吸附铀的影响示于图6。由图6可知,在ρ(U)=2～10mg/L内,菌体对铀的吸附率均在90%左右,在ρ(U)=10～50mg/L范围内,随着浓度升高吸附率降低,从91%下降到66%。但由于菌体量固定,其吸附容量随着铀初始质量浓度的增加而不断增大,从0.3mg/g增大到6.46mg/g。用Langmuir吸附等温方程对铀不同初始质量浓度下的吸附进行拟合,结果示于图7。拟合直线为1/Q=5.735/ρ+0.002,线性相关系数r=0.9996,说明吸附表现为单分子层吸附。2.5菌体用量的确定菌体用量对吸附铀的影响示于图8。如图8所示,当菌体用量ρ增加时吸附率相应增加。菌体用量从ρ=0.5mg/L上升至ρ=5mg/L时吸附率随之增加且迅速达到90%,之后随着ρ的继续增大吸附率只有较小幅度的增加。造成这种现象的原因可能是随着吸附的进行,溶液中铀浓度下降,菌体从溶液中吸附铀难度增加。2.6吸附次数对织物上吸附率的影响累积吸附实验主要是为考察该菌对铀的性能,实验结果示于图9。从图9可以看出,菌体在前3次吸附中,吸附率均达到80%,随着吸附次数的增加,吸附率逐渐下降。累计吸附量用Qm表示,初次吸附量为1.8mg/g,累积6次吸附量最终可达到6.6mg/g,若考虑到菌体烘干后质量为原来的9.2%,则菌体对铀累计吸附量达72mg/g(干重)。2.7菌体对铀的吸附共存离子对吸附铀的影响列于表1。从表1可以看出:铀的初始质量浓度为10mg/L,共存离子几乎不影响菌体对铀的吸附,仅Ca2+使微生物对铀的吸附率从93%下降到85%。其原因可能是钙离子对微生物正常生命活动起着重要作用,钙离子是细胞壁的重要组成成分,钙离子更可能结合到细胞壁上,从而减少了对铀的吸附。这个结果可能意味着土壤中钙离子含量高将不利于某些微生物对铀的固定,加速铀的迁移。2.8柠檬酸和edta的解吸能力实验考察了硝酸、柠檬酸和EDTA对吸附于菌体上铀的解吸能力,结果列于表2。从表2可以看出:解吸液体积越大解吸效果越好;其中w=5%的柠檬酸的解吸能力最强,解吸率最高为67%,硝酸的解吸能力仅次于柠檬酸,而EDTA的解吸能力最差仅为43%。这里解吸剂不能将更多的铀解吸出来的原因可能是解吸过程发生在细胞壁表面,而部分铀可能已经进入深层细胞壁甚至细胞内部,此部分铀不容易解吸出来。相比EDTA,柠檬酸和硝酸解吸能力更强一些,其原因可能是柠檬酸和硝酸的解吸液pH更低,H+浓度高不利于铀的吸附。2.9甲基铀酰红外吸收光谱和红外光谱对铀的吸附和测吸收的影响原料硝酸铀酰及吸附铀前后菌体的红外吸收光谱分析结果示于图10。由图10可以看出,菌体吸附铀前(a)和吸附铀后(b)的整体谱形并未改变,说明吸附后菌体并未发生大的变化。特征区各主要官能团的吸收峰,如3200～3500cm-1的O—H吸收峰、2923cm-1和2852cm-1处的C—H键吸收峰、1743cm-1处的CO特征吸收峰、1652cm-1处的酰胺键吸收峰、1243cm-1处的羧酸C—O键吸收峰以及1037cm-1和1078cm-1的醇或酚的C—O键吸收峰,在吸附铀前后均没有明显位移。但吸附铀后红外光谱显示在916cm-1处出现1个新的吸收峰,根据硝酸铀酰红外吸收光谱(c),在949cm-1处吸附属于UO2+2基团吸收,结合文献对甲酸铀酰化合物红外光谱研究结果,在912～952cm-1之间出现的吸收均可能是因为UO2+2的振动造成,所以吸附后的红外光谱中916cm-1处的吸收应为UO2+2振动引起的。吸收峰的位移有可能是因为UO2+2与菌体上的基团相互作用造成。然而从谱图中还不能观察出相应的官能团的位移,这可能是结合的UO2+2量太少。UO2+2与菌体上的基团键合情况有待进一步研究证明。3菌体对铀的生物吸附能力实验从拟作为低放射性废物处置场的土壤中分离得到黑霉科球孢枝孢,该菌对UO2+2具有一定的吸附能力。当UO2+2初始质量浓度为10mg/L、pH=6、菌体用量5g/L,吸附平衡时间约为24h,吸附率可达94.1%,吸附符合准二级动力学模型;pH对吸附有显著影响,最适宜pH=5～9,pH≤2时,菌体不吸附U