黑果枸杞及其制品中总花色苷含量的快速测定 pH示差法

黑果枸杞及其制品中总花色苷含量的快速测定pH示差法范围本文件规定了黑果枸杞及其制品中总花色苷含量的快速测定——pH示差法的术语、定义、原理、试剂、材料、仪器、设备、分析步骤、结果计算、结果表示和精密度。本文件适用于黑果枸杞及其制品（包括保健食品和食品，如黑果枸杞提取物、黑果枸杞片、黑果枸杞胶囊、黑果枸杞口服液、黑果枸杞颗粒冲剂等；饮料类，如黑果枸杞饮料、黑果枸杞酒等）中含量大于8.55mg/100g总花色苷的测定。其他植物源性食品（如紫皮茄子、紫薯、紫洋葱、紫甘蓝、紫白菜、大樱桃、紫葡萄、提子、蓝莓、黑树莓、黑豆、黑藜麦、黑米等）及其制品中总花色苷的测定可参照本文件执行。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法术语和定义3.1花色苷anthocyanins是花色素与糖以糖苷键结合而成的具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的类黄酮。原理溶液pH不同，花色苷的存在形式也不同。在pH值很低时，其溶液呈现最强的红色（花烊正离子），随着pH值增大，花色苷的颜色将褪至无色（甲醇假碱和查尔酮），最后在高pH值时变成紫色或蓝色（醌式（脱水）碱）。花色苷发色团的结构转换是pH的函数，起干扰作用的褐色降解物的特性不随pH变化。根据朗伯-比耳定律，在两个不同的pH下，花色苷溶液的吸光度差值与花色苷的含量成正比。因此，通过两个pH，同一波长（以花色苷最大可见吸收波长）下的吸光度差值以及在700nm处测得的用于校正略微浑浊供试液的吸光度来求得花色苷含量。5试剂和材料5.1试剂5.1.1氯化钾：分析纯。5.1.2乙酸钠：分析纯。5.1.3浓盐酸：分析纯。5.1.4无水乙醇：分析纯。5.1.5实验用水：应符合GB/T6682规定的三级水要求。5.2试剂配制5.2.1乙醇溶液（80%）的配制量取无水乙醇800mL于1000mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀。5.2.2氯化钾缓冲溶液（0.025mol/L，pH1.0）的配制称取1.86g氯化钾固体（准确至±0.001g）至2000mL烧杯中，加水约980mL溶解，加入浓盐酸调节溶液pH值至1.0±0.05后，转移至1000mL容量瓶中，混匀，定容。5.2.3乙酸钠缓冲溶液（0.4mol/L，pH4.5）的配制称取54.43g乙酸钠固体（准确至±0.001g）至2000mL烧杯中，加水约960mL溶解，加入浓盐酸调节溶液pH值至4.5±0.05后，转移至1000mL容量瓶中，混匀，定容。6仪器和设备6.1分析天平：感量为±0.0001g和±0.001g。6.2分光光度仪：具有1cm比色皿，可在400nm~900nm范围内测量吸光度。6.3pH计：精度为0.01。6.4超声波清洗机：频率40KHz，温度20~80℃，时间1~30min。6.5台式离心机：最大容量56mL，转速4000~16500r/min。6.6食物粉碎机：可将固体样品粉碎并通过425μm（40目）筛和250μm（60目）筛。6.7匀浆分散机：处理量1~2000mL（H2O），转速3000~25000r/min。7分析步骤7.1试样制备7.1.1黑果枸杞鲜果制备用四分法取适量或取全部，用匀浆分散机以15000~20000r/min转速匀浆分散20s制成匀浆后，立即用于检测，如需加水应记录加水量。整个检测过程应在避光条件下进行，以下相同。7.1.2黑果枸杞干果制备除去可见杂质后，取有代表性试样50g~100g，用食物粉碎机粉碎后，过40目筛，混匀后立即用于检测。7.1.3黑果枸杞片、颗粒制备用四分法取适量或取全部，取有代表性试样25g~50g，用食物粉碎机粉碎后，过60目筛，混匀后立即用于检测。7.1.4黑果枸杞提取物、胶囊制备胶囊需事先将内容物倒出，然后将试样置于能容纳2~5倍试样体积的带盖容器中，通过反复振摇和颠倒容器使试样充分混匀均质后立即用于检测。7.1.5黑果枸杞口服液、饮料、酒等液体制品制备通过反复振摇和颠倒盛装容器使试样充分混匀均质后立即用于检测。7.2供试品溶液的制备7.2.1黑果枸杞固体、半固体试样溶液的制备7.2.1.1称取已处理试样一定量（干果0.5g，鲜果匀浆1.0g，片剂、颗粒、粉1.0g，准确至±0.001g），置于150mL具塞磨口锥形瓶中，准确加入50mL提取液（浓HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v），密塞，称定重量。7.2.1.2放入超声波清洗机中于50℃超声提取30min，每隔10min振摇1次，保持固相完全分散。7.2.1.3提取结束后冷却至室温，再次称定重量，用提取液补足减失的重量，混匀。取部分提取液以8000r/min离心3min，取上清液备用。7.2.2黑果枸杞液体试样溶液的制备7.2.2.1准确移取已处理液体试样0.5mL~2.0mL（可依据大致花色苷含量适当调整液体试样的取用量），置于150mL具塞磨口锥形瓶中，准确加入50mL提取液（浓HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v），密塞，称定重量。7.2.2.2放入超声波清洗机中于50℃超声提取10min，每隔3min振摇1次，保持液相完全分散。7.2.2.3以下按“7.2.1.3”要求进行操作。7.3供试品检测溶液的制备7.3.1黑果枸杞固体、半固体供试品检测溶液的制备按“7.2.1”要求制备的供试品溶液先加入提取液（浓HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v）稀释2~5倍（可依据大致花色苷含量的实际情况而定），再用缓冲溶液稀释4倍，制备2份供试品检测溶液。其中一份用氯化钾缓冲溶液（0.025mol/L,pH1.0）稀释（1mL供试品溶液+3mL氯化钾缓冲溶液），另一份用乙酸钠缓冲溶液（0.4mol/L,pH4.5）稀释（1mL供试品溶液+3mL醋酸钠缓冲溶液）。7.3.2黑果枸杞液体供试品检测溶液的制备按“7.2.2”要求制备的供试品溶液直接用缓冲溶液稀释4倍，制备2份供试品检测溶液。以下按“7.3.1”要求进行操作。7.4测定7.4.1最大吸收波长的确定将“7.3”要求制备的2份供试品检测溶液静置10min后，在400nm~600nm波长之间进行全波长扫描以确定最大吸收波长。7.4.2供试品检测溶液的测定分别在最大吸收波长和700nm波长处测定用pH1.0缓冲溶液稀释的供试品检测溶液和用pH4.5缓冲溶液稀释的供试品检测溶液的吸光度值。注：在700nm处测定吸光度是用于校正略微浑浊的供试品检测溶液。但若供试品检测溶液混浊，则先通过离心或过滤使溶液澄清后再测定，以使微小的颗粒不会吸收花色苷。8结果的计算总花色苷的含量（以矮牵牛素类成分计）的质量分数，按公式（1）计算： (1)式中：——以矮牵牛素类成分计黑果枸杞及其制品中花色苷的含量，单位为克每百克（g/100g）；——pH1.0与pH4.5的供试品检测溶液的吸光度差值，A=(Amaxnm-A700nm)pH1.0-(Amaxnm-A700nm)pH4.5；——矮牵牛素类成分的平均摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol），=912.3；延伸应用于紫皮茄子：647.0；紫薯：976.6；黑豆、黑藜麦、紫洋葱：449.4；紫甘蓝：977.6；紫白菜：1014.2；大樱桃：450.7；紫葡萄：481.1；提子：487.4；蓝莓：480.2；黑树莓：450.8；黑米：451.0；——稀释因子；——提取液总体积，单位为毫升（mL）；——矮牵牛素类成分的平均摩尔消光系数，单位为升每摩尔厘米（L/（mol·cm）），=29591；延伸应用于紫皮茄子：29000；紫薯：37844；紫洋葱：28779；紫甘蓝：36902；紫白菜：34755；大樱桃：19803；紫葡萄：20605；提子：20606；蓝莓：21620；黑树莓：24344；黑豆：41019；黑藜麦：26900；黑米：19900；——比色皿厚度，单位为厘米（cm）；