枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕效果比较

枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕效果比较马静;刘志国;薛德林;索艳丽【摘要】以豆粕为主要原料，通过测定6株枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕的粗蛋白、酸溶蛋白含量,并利用SDS对发酵豆粕中的大豆抗原蛋白降解情况进行定性分析，比较枯草芽孢杆菌对豆粕的作用效果，筛选出发酵豆粕优势菌株.试验结果显示,与豆粕相比,6株枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕48、72、120h的粗蛋白和酸溶蛋白含量均有所提高，但提高的程度有所差异;菌株Y6发酵豆粕效果优于其他五株枯草芽孢杆菌，发酵120h的粗蛋白提高了15.7%,酸溶蛋白含量可达9.85%,抗原完全降解.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷)，期】2019(000)002【总页数】4页(P24-27)【关键词】枯草芽孢杆菌涸态发酵;豆粕;抗原蛋白;粗蛋白;酸溶蛋白【作者】马静;刘志国;薛德林;索艳丽【作者单位】辽宁威兰生物技术有限责任公司，辽宁沈阳110033;辽宁威兰生物技术有限责任公司，辽宁沈阳110033;辽宁威兰生物技术有限责任公司，辽宁沈阳110033;中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016;辽宁威兰生物技术有限责任公司，辽宁沈阳110033【正文语种】中文【中图分类】S816豆粕因其蛋白质含量丰富，成为目前畜牧业中使用最为广泛的植物性蛋白原料，但豆粕中含有多种抗营养因子，包括抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖、脲酶等［1］，这些抗营养因子严重影响了动物机体对豆粕中营养物质的吸收和利用，对动物机体的某些器官造成影响和损伤［2］。豆粕中抗原蛋白为大豆球蛋白（Glycinin，又称11s球蛋白，由酸性多肽和碱性多肽组成）、阳伴大豆球蛋白（阳Conglycinin，又称7s球蛋白，由a、a,、B三种亚基组成）很难去除，利用微生物发酵可以有效降解抗营养因子，在发酵过程中微生物分泌的酶可将豆粕中的大分子蛋白降解为易吸收的小分子蛋白。枯草芽孢杆菌是目前主要生产工业酶的菌种之一［3］，也是理想的微生物功能性饲料添加剂，其产生的芽孢有强的耐酸、耐胆盐、耐热等特性，维持并调整动物机体胃肠道的微生态平衡，枯草芽孢杆菌产生的酶可以促进动物的消化吸收。利用枯草芽孢杆菌进行固态发酵豆粕，可以使豆粕中的各种抗营养因子有效被降低，从而提高豆粕的饲用价值［4］。1材料与方法1.1试验材料1.1.1原料国产去皮豆粕（粗蛋白含量43%）市场采购。1.1.2菌株菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），编号Y1~Y6均由本公司实验室保藏。1.1.3培养基枯草芽孢杆菌培养基（LB培养基）：蛋白腺10g，酵母提取物5g,氯化钠10g，蒸馏水1000mL,固体培养基加入2%琼脂，高压灭菌。1.2试验方法1.2.1种子液制备将本实验室保藏的6株枯草芽孢杆菌活化后分别接种到配制好的LB培养基中，37°C振荡培养24h。1.2.2固体发酵及样品处理称取500g豆粕装于三角瓶内，将6株枯草芽孢杆菌（Y1~Y6）种子液按5%接种量接种于豆粕，即为6个试验组（I~VI），加水使发酵豆粕的最初料、水质量比为1:0.5，搅拌均匀后放置于30°C恒温培养箱中静置发酵，每个试验组分别于48、72、120h3个发酵时间点各取样3份，60C烘干后粉碎过80目筛，测定烘干样品的粗蛋白、酸溶蛋白含量以及大豆抗原蛋白的定性检测，以未发酵豆粕为对照组。1.2.3水分测定按照GB/T6435标准进行测定。1.2.4粗蛋白的测定按照GB/T6432-1994标准进行测定。1.2.5酸溶蛋白的测定按照GB/T22492-2008标准进行测定。1.2.6大豆抗原的定性分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）对抗原蛋白降解情况进行定性分析。1.2.7数据统计数据以均值士标准差表示，SPSS22.0软件进行ANOVA方差分析及Duncan's法多重比较，P<0.05为差异显著。2结果与分析2.1不同枯草芽孢杆菌菌株发酵豆粕粗蛋白及酸溶蛋白含量检测结果枯草芽孢杆菌发酵豆粕48、72、120h的粗蛋白及酸溶蛋白含量检测结果如表1和表2所示。结果显示，与对照组未发酵豆粕相比，发酵48、72、120h6个试验组发酵豆粕的粗蛋白和酸溶蛋白含量均有所提高，随着发酵时间的延长，每个试验组在不同发酵时间粗蛋白和酸溶蛋白含量比较结果均为120h>72h>48h,发酵120h效果优于发酵72h和48h。表1和表2结果显示，比较6个试验组发酵相同时间的粗蛋白及酸溶蛋白含量有所差异。发酵48h时，试验组V和V的粗蛋白差异不显著，与其他四组（I~IV）相比差异显著（P<0.05）;发酵72h时，试验组H至V的粗蛋白差异不显著，试验组VI的粗蛋白明显高于其他五组（I~V），差异显著（P<0.05）;发酵120h，试验组V的粗蛋白仍明显高于其他五组试验组（I~V），差异显著（P<0.05）;发酵48、72、120h时，试验组VI的酸溶蛋白含量均高于其他五组试验组（I~V），差异显著（P<0.05）。结果表明，发酵48、72、120h，菌株Y6发酵豆粕粗蛋白和酸溶蛋白含量均优于其他五株（Y1~Y5）枯草芽孢杆菌，发酵120h时粗蛋白提高了15.66%，酸溶蛋白含量可达9.85%。表1发酵豆粕48h、72h、120h粗蛋白含量（%）Table1Crudeproteincontentoffermentedsoybeanmealat48h,72hand120h注：发酵豆粕检测结果均按检测物中水分为10%计算；同行数据肩标相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下表同。时间48h72h120h对照组43.10±0.11e43.10±0.11d43.10±0.11e试验组I44.35±0.09d45.01±0.11c48.21±0.17dH44.26±0.08cd45.94±0.08b48.40±0.14cdB44.48±0.15cd45.65±0.24b48.07±0.12bcdIV44.56±0.25bc45.78±0.08b48.15±0.07bcV44.76±0.04ab45.95±0.11b48.49±0.09bV44.89±0.13a46.28±0.06a49.85±0.35a表2发酵豆粕48h、72h、120h酸溶蛋白含量（%）Table2Acidsolubleproteincontentoffermentedsoybeanmealat48h,72hand120h时寸间48h72h120h对照组3.72±0.07d3.72±0.07e3.72±0.07e试验组I5.92±0.13c7.77±0.11d8.47±0.13dH5.74±0.08bc7.89±0.06cd8.61±0.11cdB5.72±0.07bc7.69±0.10cd8.52±0.12bcdV5.80±0.19bc7.98±0.11c8.35±0.07bcV5.95±0.14b8.45±0.22b8.70±0.15bV6.56±0.06a8.98±0.10a9.85±0.07a2.2不同枯草芽孢杆菌菌株发酵豆粕抗原定性结果6株枯草芽孢杆菌发酵豆粕48、72、120h的SDS结果如图1所示。由图1（b）所示，与豆粕条带相比，6株菌发酵豆粕48h抗原均有部分降解，且降解程度不同，Y5与另外5株菌发酵豆粕相比7S球蛋白降解明显，Y6与另外5株菌发酵豆粕相比11S球蛋白降解明显；由图1(C)所示，与48h相比，发酵72h时6株菌发酵豆粕抗原蛋白均进一步降解，且11S球蛋白降解明显，Y1~Y6发酵豆粕相比，Y6发酵豆粕抗原降解程度最大；由图1(d)所示，与豆粕及发酵48h、72h结果相比，发酵120h,Y1~Y5菌株发酵豆粕抗原条带颜色变浅，宽度变窄，抗原基本降解，而Y6发酵豆粕抗原条带基本消失，完全降解。3讨论图1不同菌株发酵豆粕48h、72h、120hSDS结果Fig.1ResultsofSDSoffermentedsoybeanmealbydifferentstrainsfor48h,72hand120h0:豆粕；1、2、3、4、5、6分别为Y1~Y6发酵豆粕样品研究表明，豆粕中的抗原蛋白即大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白是引起动物机体过敏和腹泻的主要成分，刘明美等［5］研究大豆抗原蛋白对幼龄动物致敏作用，表明由于幼龄动物的消化器官发育不成熟，消化酶系发育不完善，消化功能不健全，进入机体内的大豆抗原蛋白可引起犊牛及仔猪的腹泻，目前使用复合酶制剂消除抗原蛋白的方法成为研究热点［6］,但是酶制剂成本较高，不利于长期、大量应用到饲料中。微生物发酵是一种有效去除抗原蛋白的手段，效率高，成本低，可明显提高饲料适口性，并且没有残留，应用安全［7］。枯草芽孢杆菌在快速繁殖过程中能产生多种酶系，如碱性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶和纤维素酶，且活性很高［8］。卓林霞等［9］研究枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕产蛋白酶，结果显示发酵豆粕中蛋白酶活力可达648U/g，较发酵前提高了2.55倍，说明枯草芽孢杆菌可通过固体发酵产生有活力的酶；程天德等［10］利用枯草芽孢杆菌发酵大豆粕，结果显示85.93%的大豆蛋白质被降解；管风波等［11］通过研究枯草芽孢杆菌发酵大豆粕产蛋白酶，结果表明枯草芽孢杆菌不同菌株具有不同的发酵能力、产酶能力。本研究应用不同菌株的枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕，相同发酵条件下，不同的时间、不同菌株发酵效果不同，发酵48h粗蛋白和酸溶蛋白含量有所升高，但抗原降解效果不明显；发酵72h粗蛋白和酸溶蛋白含量与48h相比有所提高，抗原部分降解，条带颜色变浅，且菌株Y6效果优于其他菌株；发酵120h粗蛋白提高11.5%~15.7%，酸溶蛋白含量可达9.85%，且抗原降解效果好，菌株Y6发酵120h抗原完全降解，结果说明枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕可提高粗蛋白和酸溶蛋白含量，且菌株Y6对抗原作用效果最好。利用枯草芽孢杆菌进行固态发酵豆粕，可以提高豆粕粗蛋白及酸溶蛋白含量，并且产生多种消化酶可以有效的降解豆粕中抗原蛋白。此外，发酵可产生有益代谢产物，对促进营养消化吸收、提高饲料转化率、防病和促进生长起重要作用［12］。4结论本试验利用6株枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕，对发酵不同时间的豆粕进行取样测定，结果显示，相同发酵条件下，6株菌发酵豆粕120h效果优于48h和72h,且抗原降解程度随着发酵时间的延长而增加，但不同枯草芽孢杆菌菌株发酵豆粕的粗蛋白及酸溶蛋白含量不同，且对抗原的降解作用也有所差异；枯草芽胞杆菌Y6发酵豆粕120h粗蛋白含量提高15.7%，酸溶蛋白含量可达9.85%，抗原完全降解，属于降解豆粕抗原蛋白的优势菌株。本研究通过多重比较不同枯草芽孢杆菌发酵豆粕的粗蛋白及酸溶蛋白含量变化，发现不同的菌株发酵效果有所差异，且抗原降解程度也有所区别。为了提高发酵豆粕的品质，也为发酵豆粕在饲料业的发展提供理论参考及实践指导，在今后的研究中将对发酵豆粕的影响因素做进一步筛选及分析。参考文献【相关文献】侯玉洁，徐俊，姚毅，等.发酵豆粕的营养特点及其在养猪生产中的应用研究进展[J].养猪，2017,4:17-21.田冬冬，张颖，刘志强，等.发酵豆粕在仔猪日粮中的应用研究进展[J].现代畜牧兽医，2015，6:49-53.刘颖，张彬彬，孙冰玉，等.枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化[J].食品科学，2014，35(13)：166-170.周爽，张青，齐晓芬，等枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵豆粕方法的研究[J].食品工业，2016(37)：163-168.刘明美，赵国琪.大豆抗原蛋白对幼龄动物致敏作用的研究进展[J].中国饲料，2011(14):6-8.BaoYR,WeiXQ.Researchsurveyofsoybeanantinutritionfactors[J].ChinaFoodandNutrition,2010(9):20-23.李婷琳，孙泽威.大豆抗原蛋白去除工艺的研究进展[J].大豆科学，2012,31(2):312-315.FENGJ,LIUX,XUZR,etal.Effectofferment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